中药青蒿中秦皮乙素甲基转移酶蛋白及其编码基因与应用

本发明涉及生物，特别地涉及中药青蒿中秦皮乙素甲基转移酶蛋白及其编码基因与应用。

背景技术：

1、东莨菪素(7-羟基-6-甲氧基香豆素，scopoletin)是香豆素家族的典型代表，结构式参见图1。东莨菪素衍生自碳骨架c6-c3，含有1,2-苯并吡喃酮结构中的类方晶骨架核，苯环(c6)上具有甲氧基化和羟基化修饰。东莨菪素是在拟南芥以及其它具有苯丙烷途径植物中发现的酚醛树脂中分离得到的，其药用价值在世界各地引起了极大的关注。东莨菪素体外药理活性包括抗菌，抗真菌、抗结核和抗高血压特性。已证实的体内药物生态活性包括抗炎症，缓解神经，抗糖尿病和抗高尿酸血症特性。

2、东莨菪素已经实现了大肠杆菌中生物合成。使用的关键酶包括了，4-香豆酸:辅酶a连接酶(4cl)，咖啡酸氧甲基转移酶(comt)，咖啡酰辅酶a氧甲基转移酶(ccoaomt)，阿魏酰辅酶a 6’-羟化酶(f6’h)和香豆素合成酶(cosy)。从分子结构不难看出秦皮乙素的7位羟基甲基化的直接产物即为东莨菪素，然而迄今只在杨树(populus deltoids marsh)和钝鳞紫背苔(plagiochasma appendiculatum)中鉴定了pomt9和paomt2能甲基化秦皮乙素，生成包含东莨菪素在内的多个产物。综上，鉴定直接特异生成东莨菪素的甲基转移酶，可以为东莨菪素的生物合成提供新的途径，为药物制备纯化、合成设计提供新参考。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明基于中药青蒿富集东莨菪苷，利用转录组和蛋白组筛选到aaomt1，并通过酶活鉴定其催化东莨菪素的产生。鉴定直接特异生成东莨菪素的甲基转移酶，可以为东莨菪素的生物合成提供新的途径，为药物制备纯化、合成设计提供新参考。

2、本发明的技术方案如下：

3、一种蛋白，是如下a)或b)中的蛋白质：

4、a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

5、b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有秦皮乙素甲基转移酶活性的由a)衍生的蛋白质。即，从取代和/或缺失和/或添加这三种中取一种或几种进行处理。

6、所述秦皮乙素甲基转移酶活性是催化秦皮乙素甲基化生成东莨菪素的活性。

7、所述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

8、所述编码基因为如下1)或2)或3)所示：

9、1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的dna分子；

10、2)在严格条件下与1)限定的dna分子杂交的dna分子；

11、3)与1)或2)限定的dna分子具有90％以上的同源性的dna分子。

12、该编码基因含有759个核苷酸，如序列表中序列1所示；其编码含有252个氨基酸的蛋白，如序列表中序列2所示，将该基因命名为aaomt1，将其编码的蛋白命名为aaomt1。

13、含有所述编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组微生物也属于本发明的保护范围。

14、所述蛋白在作为秦皮乙素甲基转移酶中的应用也属于本发明的保护范围。

15、所述秦皮乙素甲基转移酶活性是催化秦皮乙素甲基化生成东莨菪素的活性。

16、所述蛋白在催化秦皮乙素转化生成东莨菪素中应用也属于本发明的保护范围。

17、所述编码基因在催化秦皮乙素转化生成东莨菪素中应用也属于本发明的保护范围。

18、本发明基于发明人发现中药青蒿中特异富集东莨菪苷(高达2.24mg/g干重)，结合其它文献报道存在微量的秦皮乙素，推测其中存在的直接催化秦皮乙素生成东莨菪素的甲基转移酶。通过两个生态型中药青蒿的转录组、蛋白组筛选，找到并鉴定中药青蒿中催化秦皮乙素甲基化生成东莨菪素的甲基转移酶aaomt1，为生物合成东莨菪素提供了秦皮乙素甲基转移酶蛋白及其编码序列。与已鉴定的两个omts不同(杨树和钝鳞紫背苔的pomt9和paomt2均同时催化秦皮乙素生成东莨菪素和异东莨菪素)，aaomt1可以特异生成单一产物东莨菪素，规避了后期类似物的分离纯化难题，为生物合成东莨菪素提供了甲基转移酶序列，提供新的思路。

技术特征：

1.一种蛋白，是如下a)或b)中的蛋白质：

2.根据权利要求1所述的蛋白，其特征在于：所述秦皮乙素甲基转移酶活性是催化秦皮乙素甲基化以生成东莨菪素的活性。

3.权利要求1或2所述蛋白的编码基因。

4.根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为如下1)或2)或3)所示：

5.含有权利要求3或4所述编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组微生物。

6.权利要求1或2所述的蛋白在作为秦皮乙素甲基转移酶中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述秦皮乙素甲基转移酶活性是催化秦皮乙素甲基化以生成东莨菪素的活性。

8.权利要求1或2所述的蛋白在催化秦皮乙素转化生成东莨菪素中应用。

9.权利要求3或4所述的编码基因在催化秦皮乙素转化生成东莨菪素中应用。

技术总结
本发明公开了中药青蒿中秦皮乙素甲基转移酶蛋白及其编码基因与应用。该蛋白是如下a)或b)中的蛋白质：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有秦皮乙素甲基转移酶活性的由a)衍生的蛋白质。本发明基于中药青蒿富集东莨菪苷，利用转录组和蛋白组筛选到AaOMT1，并通过酶活鉴定其催化东莨菪素的产生。鉴定直接特异生成东莨菪素的甲基转移酶，可以为东莨菪素的生物合成提供新的途径，为药物制备纯化、合成设计提供新参考。

技术研发人员：向丽,尹青岗,师玉华,邬兰,高冉冉,韩小燕,王梦月,於化桃,陈士林
受保护的技术使用者：中国中医科学院中药研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12