一种AFLP引物及其在构建旱柳分子指纹图谱中的应用的制作方法

本发明属于植物分子育种和种质鉴定，具体涉及一种aflp引物及其在构建旱柳分子指纹图谱中的应用。

背景技术：

1、公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

2、旱柳属杨柳科柳属，具有速生、耐盐碱、无性繁殖容易等优良用材性状，是我国重要的用材树种。但旱柳极易自然杂交，杂交后代数量庞大，杂交子代幼苗期外观形态及品种特征不明显，品种鉴定难度大。利用树木成年后的外观形态特征进行品种鉴定的周期过长，生产中难以实现；且由于自然杂交的存在，导致旱柳种内性状交流现象频繁，一些品种难以鉴别。因此，如何快速、不受时间限制的对旱柳品种进行有效鉴别是促进旱柳种苗繁育的关键技术之一。

3、aflp(amplified fragment length polymorphism，扩增片段长度多态性)是由荷兰科学家pieter vos等于1995年发明的分子标记技术。其是基于pcr技术扩增基因组dna限制性片段，基因组dna先用限制性内切酶切割，然后将双链接头连接到dna片段的末端，接头序列和相邻的限制性位点序列，作为引物结合位点。它结合了rflp和pcr技术特点，具有rflp技术的可靠性和pcr技术的高效性。由于aflp扩增可使某一品种出现特定的dna谱带，而在另一品种中可能无此谱带产生，因此，这种通过引物诱导及dna扩增后得到的dna多态性可做为一种分子标记。aflp具有可靠性好，重复性强，可信度高等优点，广泛应用于遗传育种研究。然而，发明人发现，目前尚未有应用aflp分子标记技术对旱柳种质进行分子检测、鉴别等方面的报道，更未报道基于aflp引物构建旱柳分子指纹图谱及种质鉴别的报道。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明提供一种aflp引物及其在构建旱柳分子指纹图谱中的应用。本发明通过反复试验，研发出可以有效鉴别旱柳品种的aflp引物，并通过aflp技术对旱柳品种进行分子指纹图谱的构建，可以为旱柳品种鉴定提供有效的技术参考和支持。基于上述研究结果，从而完成本发明。

2、具体的，本发明涉及以下技术方案：

3、本发明的第一个方面，提供一种aflp引物对，所述aflp引物对如seq id no.1-2所示、如seq id no.3-4所示、如seq id no.5-2所示、如seq id no.6-4所示、如seq id no.6-7所示、如seq id no.6-2所示、或如seq id no.6-8所示所示。

4、进一步的，所述aflp引物对如seq id no.1-2所示。

5、本发明的第二个方面，提供一种aflp引物组，所述aflp引物组由以下引物对中的两种或两种以上组成：如seq id no.1-2所示、如seq id no.3-4所示、如seq id no.5-2所示、如seq id no.6-4所示、如seq id no.6-7所示、如seq id no.6-2所示、和如seqidno.6-8所示。

6、本发明的第三个方面，提供一种试剂盒，所述试剂盒至少包含上述aflp引物对或引物组。

7、所述试剂盒还可以包括pcr扩增常用的酶、试剂以及缓冲液等，诸如dna聚合酶、dntps、pcr反应缓冲液中的一种或多种，在此不做具体限定。

8、本发明的第四个方面，提供上述aflp引物对、引物组或试剂盒在如下任意一种或多种中的应用：

9、1)旱柳遗传多样性分析；

10、2)构建旱柳遗传图谱；

11、3)旱柳种质鉴定；

12、4)旱柳亲缘关系分析；

13、5)旱柳功能基因挖掘；

14、6)旱柳分子标记辅助育种。

15、其中，所述2)中，构建旱柳遗传图谱具体为构建旱柳aflp指纹图谱以及旱柳分子身份证。

16、所述3)中，旱柳种质鉴定至少包括对旱柳品种的鉴定。

17、因此，本发明的第五个方面，提供一种构建旱柳aflp指纹图谱的方法，所述方法至少包括：使用上述aflp引物对、引物组或试剂盒对待测样本的dna依次进行aflp酶切与连接反应、连接产物的预扩增、对预扩增产物的选择性扩增，检测aflp的选择性扩增产物。

18、其中，所述待测样本为收集得到的旱柳样本。

19、进一步的，上述方法还包括构建旱柳分子身份证，包括：设定marker片段范围大小为70～500bp，每2个碱基读取一个数，共读取216个数；统计时每9个数统计一次片段个数，共24个数，构成24位的指纹密码，即构建得到旱柳分子身份证。

20、以上一个或多个技术方案的有益技术效果：

21、上述技术方案通过筛选出的aflp引物对，可快速有效的通过aflp实验方法将旱柳各品种区分鉴别出来；并通过旱柳指纹图谱的建立，补充完善旱柳种的aflp指纹图谱；而旱柳分子身份证的建立，可有效认定识别旱柳种质，提高了旱柳品种鉴定效率，因此具有良好的实际应用之价值。

技术特征：

1.一种aflp引物对，其特征在于，所述aflp引物对如seq idno.1-2所示、如seq idno.3-4所示、如seq id no.5-2所示、如seq id no.6-4所示、如seq id no.6-7所示、如seqid no.6-2所示、或如seq id no.6-8所示所示。

2.如权利要求1所述的aflp引物对，其特征在于，所述aflp引物对如seq id no.1-2所示。

3.一种aflp引物组，其特征在于，所述aflp引物组由以下引物对中的两种或两种以上组成：如seq id no.1-2所示、如seq idno.3-4所示、如seq id no.5-2所示、如seq idno.6-4所示、如seq id no.6-7所示、如seq id no.6-2所示、和如seq id no.6-8所示。

4.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少包含权利要求1-2任一项所述aflp引物对或权利要求3所述引物组。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dna聚合酶、dntps、pcr反应缓冲液中的一种或多种。

6.权利要求1或2所述aflp引物对、权利要求3所述引物组或权利要求4或5所述试剂盒在如下任意一种或多种中的应用：

7.如权利要求6所述应用，其特征在于，所述应用2)中，构建旱柳遗传图谱具体为构建旱柳aflp指纹图谱以及旱柳分子身份证；

8.一种构建旱柳aflp指纹图谱的方法，其特征在于，所述方法至少包括：使用上述aflp引物对、引物组或试剂盒对待测样本的dna依次进行aflp酶切与连接反应、连接产物的预扩增、对预扩增产物的选择性扩增，检测aflp的选择性扩增产物。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述待测样本为旱柳样本。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法还包括构建旱柳分子身份证，包括：设定marker片段范围大小为70～500bp，每2个碱基读取一个数，共读取216个数；统计时每9个数统计一次片段个数，共24个数，构成24位的指纹密码，即构建得到旱柳分子身份证。

技术总结
本发明属于植物分子育种和种质鉴定技术领域，具体涉及一种AFLP引物及其在构建旱柳分子指纹图谱中的应用。本发明通过筛选出的AFLP引物对，可快速有效的通过AFLP实验方法将旱柳各品种区分鉴别出来；并通过旱柳指纹图谱的建立，补充完善旱柳种的AFLP指纹图谱；而旱柳分子身份证的建立，可有效认定识别旱柳种质，提高了旱柳品种鉴定效率，因此具有良好的实际应用之价值。

技术研发人员：于振旭,秦光华,高明宇,臧真荣,张林
受保护的技术使用者：山东省林业科学研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13