一种与胶原具有特异结合能力VEGF活性抑制蛋白及其制备方法与应用

本发明属于基因工程，具体涉及一种与胶原具有特异结合能力vegf活性抑制蛋白及其制备方法与应用，尤其涉及该抑制蛋白在制备用于治疗由于大量新生血管生成所引发的视网膜新生血管性疾病的药物中的应用。

背景技术：

1、多种视网膜疾病与新生血管有关，该类疾病的共同病理改变是视网膜由于缺血、缺氧而产生新生血管，进而血管发生渗漏、增殖、牵拉，导致反复玻璃体积血、牵拉性视网膜脱离及新生血管性青光眼，病程进展迅速，如不及时治疗，最终会导致失明。

2、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，vegf)，是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用。vegfr主要包括vegfr1、vegfr2、vegfr3，其中vegfr2是血管新生和有丝分裂过程主要的vegf信号转导受体。vegf/vegfr2所介导的信号级联通路可以调控血管内皮细胞的增殖、迁移、存活，引起血管通透性的改变，控制血管的新生。

3、现有技术中，治疗与新生血管有关的视网膜疾病，主要采用内皮生长因子单克隆抗体药物和可溶性flt-1和kdr药物。其治疗原理类似，均为与细胞表面vegfr受体竞争性结合游离的vegf，最终实现抑制眼底血管增生的能力。但是这两种药物在体内的半衰期短，也会被体内蛋白酶降解，为了维持药物的抑制血管的作用，需要持续、频繁的给药才能达到理想的作用效果。频繁的、高剂量的眼内注射给药，会增加眼内感染风险，同时也给患者造成生活上的不便。

技术实现思路

1、本发明为解决现有技术中治疗与新生血管有关的视网膜疾病的药物均不具有在玻璃体内长效的作用机制等技术问题，提供一种与胶原具有特异结合能力vegf活性抑制蛋白及其制备方法与应用。

2、本发明解决上述技术问题采取的技术方案如下。

3、本发明的与胶原具有特异结合能力vegf活性抑制蛋白，包括以下氨基酸序列：seqid no：1。

4、本发明还提供上述与胶原具有特异结合能力vegf活性抑制蛋白的制备方法为：

5、将氨基酸序列seq id no：1克隆入质粒中，得到的重组质粒转化入大肠杆菌中进行诱导表达，诱导表达结束后，离心收集菌体，并将菌体破碎，再离心获得上清蛋白，上清蛋白经过亲和层析进行纯化，脱盐层析，分子筛柱纯化，获得血管内皮生长因子抑制蛋白。

6、优选的是，使用ned1和xhoii将氨基酸序列seq id no：1克隆入pet21b质粒中。

7、优选的是，所述诱导表达的温度为37℃。

8、优选的是，所述诱导表达采用的诱导剂为iptg，更优选的是，诱导剂的浓度为0.2mm。

9、优选的是，所述离心收集菌体的离心转速为4000rpm。

10、优选的是，所述菌体破碎采用的设备为超声波破碎仪。

11、优选的是，所述离心获得上清蛋白的离心转速为13000rpm。

12、优选的是，亲和层析采用ni-nta亲和层析柱，使用wash buffer洗涤杂蛋白，然后使用elution buffer洗脱蛋白。

13、优选的是，过g25脱盐柱进行脱盐层析。

14、优选的是，分子筛柱纯化使用superdex75分子筛柱子对蛋白进行纯化，流速为0.5ml/min。

15、本发明还提供上述与胶原具有特异结合能力vegf活性抑制蛋白在制备用于治疗视网膜新生血管性疾病的药物中的应用。

16、优选的是，所述与胶原具有特异结合能力vegf活性抑制蛋白的浓度为＞100pm。

17、本发明还提供含有上述与胶原具有特异结合能力vegf活性抑制蛋白的治疗视网膜新生血管性疾病的药物。

18、优选的是，所述与胶原具有特异结合能力vegf活性抑制蛋白的浓度为＞100pm。

19、本发明的原理为：本发明的与胶原具有特异结合能力vegf活性抑制蛋白序列中包含vegfr1和vegfr2的细胞外功能结构域，这个结构域主要负责与游离的vegf结合降低其生物学活性，序列中n端包含也包括与胶原特异结合的氨基酸序列(mtkktlrt)，这个氨基酸序列来源于胶原酶，胶原酶和胶原是酶和底物的关系，因此能够特异性的结合。故而本发明的与胶原具有特异结合能力vegf活性抑制蛋白就具有了和胶原结合和vegf结合的双效功能，不但能够抑制vegf的活性，同时也能和玻璃体内的胶原结合，结合后的蛋白能够更加稳定的滞留在玻璃体内，延长药物的半衰期和作用时间。从而减少药物使用量，并降低副作用，减轻患者的负担。

20、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

21、本发明的与胶原具有特异结合能力vegf活性抑制蛋白，利用基因工程重组技术，在新型vegf拮抗蛋白末端加入能够特异结合胶原蛋白的氨基酸序列，使得此类vegf拮抗蛋白具有在玻璃体内能够与胶原蛋白结合的功能，通过延长药物在体内的半衰期和作用时间，从而减少给药频次和给药剂量，因此能够极大的解决目前此类药物存在的副作用。

22、本发明的与胶原具有特异结合能力vegf活性抑制蛋白安全，稳定，药效明确直接，毒副作用小，不易于产生耐药性，存储和运输条件较为温和。

技术特征：

1.与胶原具有特异结合能力vegf活性抑制蛋白，其特征在于，包括以下氨基酸序列：seq id no：1。

2.权利要求1所述的与胶原具有特异结合能力vegf活性抑制蛋白的制备方法，其特征在于：

3.根据权利要求2所述的与胶原具有特异结合能力vegf活性抑制蛋白的制备方法，其特征在于，

4.根据权利要求2所述的与胶原具有特异结合能力vegf活性抑制蛋白的制备方法，其特征在于，

5.根据权利要求2所述的与胶原具有特异结合能力vegf活性抑制蛋白的制备方法，其特征在于，

6.根据权利要求2所述的与胶原具有特异结合能力vegf活性抑制蛋白的制备方法，其特征在于，

7.权利要求1所述的与胶原具有特异结合能力vegf活性抑制蛋白或者权利要求2-6任何一项所述的与胶原具有特异结合能力vegf活性抑制蛋白的制备方法制备的与胶原具有特异结合能力vegf活性抑制蛋白在制备用于治疗视网膜新生血管性疾病的药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的与胶原具有特异结合能力vegf活性抑制蛋白或者权利要求2-6任何一项与胶原具有特异结合能力vegf活性抑制蛋白的制备方法制备的与胶原具有特异结合能力vegf活性抑制蛋白在制备用于治疗视网膜新生血管性疾病的药物中的应用，其特征在于，所述与胶原具有特异结合能力vegf活性抑制蛋白的浓度为＞100pm。

9.含有权利要求1所述的与胶原具有特异结合能力vegf活性抑制蛋白或者权利要求2-6任何一项与胶原具有特异结合能力vegf活性抑制蛋白的制备方法制备的与胶原具有特异结合能力vegf活性抑制蛋白的治疗视网膜新生血管性疾病的药物。

10.权利要求9所述的治疗视网膜新生血管性疾病的药物，其特征在于，所述与胶原具有特异结合能力vegf活性抑制蛋白的浓度为＞100pm。

技术总结
本发明涉及一种与胶原具有特异结合能力VEGF活性抑制蛋白及其制备方法与应用，属于基因工程技术领域。解决了现有技术中治疗与新生血管有关的视网膜疾病的药物均不具有在玻璃体内长效的作用机制等技术问题。本发明的与胶原具有特异结合能力VEGF活性抑制蛋白，包括以下氨基酸序列：SEQ IDNO：1。该与胶原具有特异结合能力VEGF活性抑制蛋白，通过延长药物在体内的半衰期和作用时间，从而减少给药频次和给药剂量，因此能够极大的解决目前此类药物存在的副作用；且抑制蛋白安全，稳定，药效明确直接，毒副作用小，不易于产生耐药性，存储和运输条件较为温和。

技术研发人员：左玲,燕洪涛
受保护的技术使用者：吉林大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15