一种水稻两系不育系ACCase突变型基因和蛋白及其应用的制作方法

本发明涉及植物基因和蛋白领域，具体涉及一种水稻两系不育系accase突变型基因和蛋白及其应用。

背景技术：

1、杂草与水稻相伴而生，竞争水、肥、光等非生物资源，同时为多种病虫害提供了寄主。因此，稻田杂草的存在严重影响着水稻的生长发育、产量和品质形成等。据报道，在造成水稻减产的所有因素中草害所占比例高达34％。相较于人工除草、轮作、生物防治、浅耕灭草等传统技术，利用除草剂进行化学防治具有高效、经济、省力、不改变土层结构等优点。

2、近年来，随着我国工农业、城市化进程的高速发展，导致农村劳动力纷纷向城市转移，我国水稻生产也在向规模化、集约化、机械化方向发展。因此机插秧、直播等轻简化栽培措施已成为发展趋势。其中直播技术由于具有轻型、高效、节水、省工等的优点，备受农民喜爱，直播面积从2007年以前的2％到目前逐步提升，为保障水稻的稳产和增产发挥了重要作用。但直播稻田杂草发生种类多、出草时间长、草害较重等，若防治技术不到位极易导致水稻大幅度减产甚至绝收，而且严重影响其生长发育和品质等。

3、杂交水稻机械化制种是突破其进一步推广瓶颈的必然需求，对于保障世界粮食安全，提高我国种业国际市场竞争力具有重要意义。将抗除草剂基因导入光温敏雄性核不育系或野败型不育系，以普通恢复系作父本，在授粉后喷施除草剂，不育系因对除草剂表现抗性而正常生长，恢复系因不具备抗除草剂基因被除草剂杀死，待成熟期通过机械收割而获得所需的杂交水稻种子。

4、然而，大多使用效果好的除草剂为杀生性类型，施用不当常常会对水稻造成不同程度的药害，影响其生长发育以及产量。因此，培育具有除草剂抗性的水稻品种或不育系材料是防治稻田杂草危害、实现机械化制种等最为经济、有效的措施。除草剂一般通过在作物特定蛋白特殊位点发挥功能，因此相关位点的氨基酸突变可能为植物带来抗除草剂效果。氨基酸突变的开发是当前开发非转基因抗除草剂植物的主要技术路径。因此，培育抗除草剂水稻品种，关键问题是需要抗除草剂的突变蛋白及编码基因。

5、1957年，wakil等从鸽子肝脏提取液中分馏纯化获得r1～r44组分，其中r1在1958年被证明含有大量生物素，并参与了以乙酰辅酶a(acetyl-coa)为底物的长链脂肪酸合成，由此乙酰辅酶a羧化酶(acetyl-coacarboxylase，简称accase)被首次分离出来，并被证实参与生物体内脂肪酸的合成(evidence for the participation of biotin in theenzymic synthesis of fatty acids.biochimica et biophysica acta，1958，29(1)：225-226)。精喹禾灵是国内农业生产中广泛使用的一种苯氧羧酸酯类除草剂，化学名称2-[4-(6-氯-2-喹噁啉氧基)-苯氧基]丙酸乙酯，是一种有较好选择性的除草剂。它被杂草叶片吸收后，可以扩散到整个杂草植株体内并在分生组织内累积，抑制杂草植株对脂肪酸等物质的合成，还通过抑制羧基转移酶(carboxy1 transferase，ct)抑制乙酰辅酶a羧化酶的生成，破坏了分生组织的生长进而使得杂草死亡。研究表明，低浓度的精喹禾灵可以促进水稻幼苗的生长发育，但是随着精喹禾灵浓度的增高，这种促进现象则会转为抑制效应，阻碍水稻幼苗的正常生长。

技术实现思路

1、针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种水稻accase突变型蛋白，所用受体材料为两系不育系，以便于解决上述水稻直播带来的杂草问题，以及通过除草剂对水稻机械化制种父本的去除度等。本发明通过化学试剂ems诱变筛选水稻野生型两系不育系贡887s，得到一种抗精喹禾灵类除草剂的水稻accase突变型蛋白材料两系不育系种质l887s-83。

2、为了达到上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

3、提供一种水稻两系不育系accase突变型蛋白，accase突变型蛋白经过氨基酸序列改变或替换：水稻野生型两系不育系贡887s的accase基因编码区第2282位、第6030位2个碱基的突变导致2个氨基酸的替换，核酸序列如seq id no.2所示序列。

4、优选地，本发明的突变型蛋白(突变材料l887s-83)为水稻accase的氨基酸序列第761位由异亮氨酸(i，ile)突变为丝氨酸(s，ser)、第2010位由色氨酸(w，trp)突变为半胱氨酸(c，cys)而构成，氨基酸序列如seq id no.1所示序列。

5、优选地，本发明的accase突变型蛋白的保护范围不仅限于上述突变，在上述突变蛋白氨基酸序列第761位和第2010位突变成其他氨基酸的情况也在本发明的保护范围之内。

6、本发明还提供了获得具有除草剂精喹禾灵抗性水稻两系不育系的方法。具体地，使水稻两系不育系包含所述accase突变基因核酸序列，或使水稻两系不育系表达所述accase突变型蛋白，干扰accase酶的活性。

7、进一步地，所述获得具有除草剂抗性两系不育系水稻的方法为利用化学试剂ems诱变水稻野生型材料贡887s种子，播种后利用除草剂精喹禾灵筛选诱变成功单株，进而获得包含除草剂精喹禾灵抗性基因的水稻单株l887s-83，然后对相应单株种子进行培育、繁殖等。

8、本发明所述的增强水稻对除草剂的抗性方法可以通过遗传转化或者杂交、自交和无性繁殖等方法实施，也可通过化学诱变或物理诱变等方式获得，改变水稻植株具有本发明的accase基因核苷酸序列seq id no.2的突变位点，所述的突变后的水稻植株具有上述突变后的核苷酸序列均在本专利的保护范围。

9、本发明的有益效果为：

10、本发明公开了一种水稻两系不育系accase突变型基因和蛋白及其应用。accase突变型基因序列对应于野生型accase基因全长第6566位、第12328位2个碱基的突变，相应于accase基因编码区第2282位、第6030位2个碱基的突变，导致accase突变型蛋白的氨基酸序列对应于野生型水稻第761位由异亮氨酸突变为丝氨酸、第2010位由色氨酸突变为半胱氨酸，从而使水稻accase突变型基因表达的突变蛋白可以抗乙酰辅酶a羧化酶类除草剂精喹禾灵。accase突变型蛋白的两系不育系及其组合材料在幼苗4叶期施用10ml/l精喹禾灵溶液后，仍然可以正常生长发育和结实。

技术特征：

1.一种水稻两系不育系accase突变型蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列对应于野生型水稻两系不育系accase蛋白氨基酸序列第761位和第2010位发生突变而获得。

2.根据权利要求1所述的水稻两系不育系accase突变型蛋白，其特征在于，

3.一种核酸或基因，其特征在于，其编码权利要求1～2任一项所述的水稻两系不育系accase突变型蛋白，其核苷酸序列如seq id no.2所示。

4.权利要求1或2所述的水稻两系不育系accase突变型蛋白、权利要求3所述的核酸或基因在水稻抗除草剂方面的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述除草剂是精喹禾灵。

6.一种获得具有除草剂抗性的水稻的方法，其特征在于，包括如下步骤：

7.根据权利要求6所述的获得具有除草剂抗性的水稻的方法，其特征在于，将水稻accase突变型基因通过理化诱变、crispr/cas9基因编辑、转基因技术，或通过杂交、回交利用分子标记辅助技术将突变基因导入水稻受体细胞，或无性繁殖培育水稻受体突变型细胞，从而使所获得的水稻植株具有抗除草剂性状。

8.一种鉴定抗除草剂水稻的方法，所鉴定的水稻品系包含权利要求3所述的核酸或基因，表达权利要求1或2所述的蛋白，或权利要求6或7所述的方法获得的水稻品系，其特征在于，包括以下步骤：

9.一种控制杂草的方法，其特征在于，包括：对水稻的大田施用有效剂量的除草剂，所述水稻包含根据权利要求3所述的核酸或基因，所述除草剂为精喹禾灵。

10.一种用于保护水稻免受由除草剂引起的损伤的方法，其特征在于，包括：对种植水稻材料的大田施用有效剂量的除草剂精喹禾灵，所述水稻材料包含权利要求3所述的核酸或基因，采用权利要求7所述的方法将accase突变基因导入水稻品种或品系，导入后的水稻品种或品系产生除草剂抗性蛋白。

技术总结
本发明公开了一种水稻两系不育系ACCase突变型基因和蛋白及其应用。ACCase突变型基因序列对应于野生型ACCase基因全长第6566位、第12328位2个碱基的突变，相应于ACCase基因编码区第2282位、第6030位2个碱基的突变，导致ACCase突变型蛋白的氨基酸序列对应于野生型水稻第761位由异亮氨酸突变为丝氨酸、第2010位由色氨酸突变为半胱氨酸，从而使水稻ACCase突变型基因表达的突变蛋白可以抗乙酰辅酶A羧化酶类除草剂精喹禾灵。ACCase突变型蛋白的两系不育系及其组合材料在幼苗4叶期施用10mL/L精喹禾灵溶液后，仍然可以正常生长发育和结实。

技术研发人员：张阳军,林勇,张国文,于江辉,邓燕燕,严秋平,廖天一,付新民
受保护的技术使用者：北京金色农华种业科技股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13