一种基于IgE线性表位构建α-乳白蛋白的抗原表位肽及低检测限定量检测α-乳白蛋白的方法

本发明属于α-乳白蛋白定量检测方法领域，具体涉及一种可以实现低检测限定量检测α-乳白蛋白的方法。

背景技术：

1、牛乳作为一种人们常用的优质营养补充食品，也是常见的过敏食物之一，但是牛乳过敏已被确认为儿童早期食物过敏的最常见的过敏之一，约占所有儿童食物过敏的五分之一，被世界各国广泛关注。在中国，婴儿牛乳过敏的患病率已高达2.69％，严重患儿甚至在食用低至0.6mg的牛乳蛋白即会引起过敏反应。牛乳中蛋白含量丰富，每升牛乳含有约30-35克蛋白质，含有超过25种不同的蛋白质，目前普遍认为牛乳中的主要过敏原为酪蛋白、β-乳球蛋白及α-乳白蛋白，而乳清作为食品工业当中最常用的食物原料，其中的β-乳球蛋白和α-乳白蛋白占总乳蛋白的15％，是最重要过敏原。

2、食物过敏原检测通常按原理主要分为三类：基于分子生物学的检测方法，色谱学方法和基于免疫学的检测方法。基于分子生物学的检测方法是通过对过敏食物特异性dna片段进行扩增来实现的，由于dna在热处理和高压下保持较长时间的完整性，所以这类方法要求高稳定性、高自动化，但不能检测到过敏原蛋白，只能瞄准其表达的特征dna片段，且dna含量与蛋白含量没有量效关系，仅适合检测核酸含量高的样品，如花生、坚果、大豆、鱼和甲壳等。色谱学方法具有灵敏度高，准确性好，检出限低，专一性强等优点，但仪器设备较复杂，需要专门的培训人才，且价格昂贵可能会限制其在食品工业中的广泛应用。免疫学的检测方法中，酶联免疫吸附法(elisa)作为应用范围最广的检测方法，也是鉴定生物分子的最有效测定之一，其具备特异性强、灵敏度高、可实现准确的定量检测大批量样品等优点，已广泛应用于临床诊断，食品常规分析，环境分析和实验室研究。其中根据elisa的检测类型，其可分为间接竞争型elisa和夹心型elisa，其中间接竞争型elisa更适合于检测分子或小分子。由于α-乳白蛋白在被水解破坏成小片段后，存在相似作用表位的过敏原导致发生交叉过敏反应，而常出现假阳性现象。夹心型elisa更适合于食物蛋白中的小分子过敏原，由于酶标二抗能在识别检测抗体的同时，难以识别捕获抗体，所以体系的特异性也得到了保障。酶联免疫吸附法(elisa)的关键需要解决的技术问题是找到一种α-乳白蛋白相对应的抗原表位肽，从而实现灵敏度高，高精度，低检测限地对于食物基质中的α-乳白蛋白含量的检测。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种可以实现低检测限定量检测α-乳白蛋白的方法，解决现有食物基质α-乳白蛋白含量检测方法中检出限较高，灵敏度偏低的技术问题。

2、为解决以上技术问题，本发明公开了一种基于ige线性表位构建α-乳白蛋白的抗原表位肽，抗原表位肽的氨基酸序列为ndsteyglfqinnkiw。

3、本发明公开了一种低检测限定量检测α-乳白蛋白的方法，包括以下步骤，

4、s1，合成基于ige线性表位构建α-乳白蛋白的抗原表位肽，所述抗原表位肽的氨基酸序列为ndsteyglfqinnkiw；

5、s2，将所述抗原表位肽和血蓝蛋白偶联得到完全抗原；

6、s3，以所述完全抗原为抗原免疫小鼠，制备得到单克隆抗体；

7、s4，以所述单克隆抗体为捕获抗体，生物素化α-乳白蛋白多克隆抗体为检测抗体，采用selisa方法检测食物基质中的α-乳白蛋白的含量。

8、作为优选地，所述抗原表位肽和天冬酰胺、半胱氨酸偶联得到的阻断肽，所述阻断肽用于筛选小鼠、细胞株，所述阻断肽氨的基酸序列为n-ndsteyglfqinnkiw-c。

9、作为优选地，所述单克隆抗体利用所述阻断肽进行小鼠、细胞株的筛选。

10、作为优选地，s4中采用selisa方法检测过程中，所述单克隆抗体作为捕获抗体的工作浓度为2μg/ml。

11、作为优选地，s4中采用selisa方法检测过程中，生物素化α-乳白蛋白多克隆抗体作为检测抗体的工作浓度为1μg/ml。

12、与现有技术相比，本发明获得的有益效果是：

13、本发明通过采用selisa方法实现对食物基质当中α-乳白蛋白的定量检测和分析，基于ige线性表位构建α-乳白蛋白的aa64～79抗原表位肽，所述抗原表位肽的氨基酸序列为ndsteyglfqinnkiw，将所述抗原表位肽和血蓝蛋白偶联得到完全抗原，以所述完全抗原为抗原免疫小鼠制备得到单克隆抗体，以所述单克隆抗体作为捕获抗体，生物素化α-乳白蛋白多克隆抗体为检测抗体，对食物基质当中含有作用表位的肽段具有极高的特异性，能够准确地检测出任何食品基质乳制品中的α-乳白蛋白及其致敏性残基，本发明公开的可以实现低检测限定量检测α-乳白蛋白的方法，解决了现有食物基质α-乳白蛋白含量检测方法中检出限较高，灵敏度偏低的技术问题，具有线性检测范围更大，检出限更低，灵敏度更高的有益效果。

技术特征：

1.一种基于ige线性表位构建α-乳白蛋白的抗原表位肽，其特征在于，抗原表位肽的氨基酸序列为ndsteyglfqinnkiw。

2.一种低检测限定量检测α-乳白蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤，

3.如权利要求2所述的低检测限定量检测α-乳白蛋白的方法，其特征在于，所述抗原表位肽和天冬酰胺、半胱氨酸偶联得到的阻断肽，所述阻断肽氨的基酸序列为n-ndsteyglfqinnkiw-c。

4.如权利要求3所述的低检测限定量检测α-乳白蛋白的方法，其特征在于，所述单克隆抗体利用所述阻断肽进行小鼠、细胞株的筛选。

5.如权利要求2所述的低检测限定量检测α-乳白蛋白的方法，其特征在于，s4中采用selisa方法检测过程中，所述单克隆抗体作为捕获抗体的工作浓度为2μg/ml。

6.如权利要求2所述的低检测限定量检测α-乳白蛋白的方法，其特征在于，s4中采用selisa方法检测过程中，生物素化α-乳白蛋白多克隆抗体作为检测抗体的工作浓度为1μg/ml。

技术总结
本发明通过采用sELISA方法实现对食物基质当中α‑乳白蛋白的定量检测和分析，基于IgE线性表位构建α‑乳白蛋白的AA64～79抗原表位肽，所述抗原表位肽的氨基酸序列为NDSTEYGLFQINNKIW，将所述抗原表位肽和血蓝蛋白偶联得到完全抗原，以所述完全抗原为抗原免疫小鼠制备得到单克隆抗体，以所述单克隆抗体作为捕获抗体，生物素化α‑乳白蛋白多克隆抗体为检测抗体，对食物基质当中含有作用表位的肽段具有极高的特异性，能够准确地检测出任何食品基质乳制品中的α‑乳白蛋白及其致敏性残基。

技术研发人员：李欣,陈红兵,叶茂,邱毓,陈思懿,高金燕,武涌,孟轩夷,谢彦海,谭宏凯,吴志华,杨安树
受保护的技术使用者：南昌大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13