用于猴疱疹病毒实时荧光环介导等温扩增检测的LAMP引物、试剂盒和方法与流程

本申请属于病原微生物的检测领域，尤其是涉及猴疱疹病毒，具体涉及用于猴疱疹病毒实时荧光环介导等温扩增检测的lamp引物，以及相关的试剂盒和检测猴泡沫病毒的方法。

背景技术：

1、猴b病毒(monkey b virus,bv)，即猴疱疹病毒1型(macacine alphaherpesvirus1)，属疱疹病毒科、α-疱疹病毒亚科、单纯疱疹病毒属。猴b病毒是非人灵长类动物携带的人畜共患病毒中最具潜在危险的病毒，其自然宿主是猕猴，在猕猴中普遍存在，主要通过交配、抓伤或咬伤等途径传播，猴一旦感染，将终生携带该病毒，一般不表现或很少表现出临床症状，感染症状与人感染单纯疱疹病毒i型(hsv-1)和人单纯疱疹病毒ii型(hsv-2)相似，通常呈良性经过。常见症状为口腔疱疹样损伤，如口腔溃疡、结膜炎等，没有生殖道损伤症状，能自愈。bv对人是一种低感染率，但人一旦感染，患者会出现严重的中枢神经系统疾病，导致永久性神经功能障碍或死亡，未经治疗的患者疾病严重程度增加，致死率约为80％。

2、已有的猴b病毒检测方法主要包括病毒的分离培养法、血清学方法、核酸检测方法。其中，病毒的分离培养是猴b病毒感染检测的金标准，但是该方法灵敏度低、耗时长，并且猴b病毒属于生物安全4级病原微生物，它的培养条件要求严格，仅能在国家规定的特定实验室进行。猴b病毒与人单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，hsv)、非洲绿猴疱疹病毒(simian agent8，sa8)、狒狒疱疹病毒(herpesvirus papio 2，hvp2)有交叉反应，常导致血清学检测出现假阳性结果。核酸检测方法由于其快速、灵敏、特异性高并且减少了病毒培养的危险性而具有很大优势。近年来，国内外已有关于猴b病毒的实时荧光定量pcr检测方法报道，但多数存在猴b病毒检测引物探针特异性或通用性差的问题，易导致假阳性或假阴性检测结果的发生。

技术实现思路

1、针对目前的技术问题，本发明的一个方面涉及用于猴疱疹病毒实时荧光环介导等温扩增检测的lamp引物，其中，

2、f3引物：5’-acgaccttgccgaccg-3’(seq id no:1)；

3、b3引物：5’-ttcgtgcccctggagg-3’(seq id no:2)；

4、fip引物：5’-gtcatcaaggccgacgcgcagaggccctcgaagaaggagt-3’(seq id no:3)；

5、bip引物：5’-ggagcgcgtggagctggttcgccaggagatcaaggacag-3’(seq id no:4)；

6、lb引物：5’-tgtagtccagcagcccg-3’(seq id no:5)。

7、本发明的某具体实施方案中，所述引物其用于检测猴疱疹病毒i型。

8、本发明另一个方面涉及用于猴疱疹病毒实时荧光环介导等温扩增检测的试剂盒，其包含，

9、f3引物：5’-acgaccttgccgaccg-3’(seq id no:1)；

10、b3引物：5’-ttcgtgcccctggagg-3’(seq id no:2)；

11、fip引物：5’-gtcatcaaggccgacgcgcagaggccctcgaagaaggagt-3’(seq id no:3)；

12、bip引物：5’-ggagcgcgtggagctggttcgccaggagatcaaggacag-3’(seq id no:4)；

13、lb引物：5’-tgtagtccagcagcccg-3’(seq id no:5)。

14、所述试剂盒进一步包含lamp反应缓冲液和dna聚合酶，和/或反应耗材和说明书。

15、本发明的另一个方面涉及用于猴疱疹病毒实时荧光环介导等温扩增检测的方法，其采用的引物为：

16、f3引物：5’-acgaccttgccgaccg-3’(seq id no:1)；

17、b3引物：5’-ttcgtgcccctggagg-3’(seq id no:2)；

18、fip引物：5’-gtcatcaaggccgacgcgcagaggccctcgaagaaggagt-3’(seq id no:3)；

19、bip引物：5’-ggagcgcgtggagctggttcgccaggagatcaaggacag-3’(seq id no:4)；

20、lb引物：5’-tgtagtccagcagcccg-3’(seq id no:5)。

21、所述的猴疱疹病毒实时荧光环介导等温扩增检测的方法，其包括如下步骤，

22、步骤1，提取待检测样本的基因组dna；

23、步骤2，根据反应体系，将步骤1所得的基因组dna、引物、lamp反应缓冲液以及dna聚合酶混合，以放入实时荧光检测仪上进行扩增反应，并检测荧光信号。

24、其反应体系及扩增程序为：

25、20μl反应体系，包含：

26、2×rt-bst lamp mastermix 10μl、

27、5×lamp primer mix 4μl，包含8μm fip、8μm bip、1μm f3、1μm b3、2μm lb、

28、待检模板dna2μl，

29、无菌去离子水；

30、于65℃进行反应25min(sybr通道)，每1min收集一次荧光信号，80℃保持2min。

技术特征：

1.用于猴疱疹病毒实时荧光环介导等温扩增检测的lamp引物，其中，

2.根据权利要求1所述的用于猴疱疹病毒实时荧光环介导等温扩增检测的lamp引物，其用于检测猴疱疹病毒i型。

3.用于猴疱疹病毒实时荧光环介导等温扩增检测的试剂盒，其包含，

4.根据权利要求3所述的用于猴疱疹病毒实时荧光环介导等温扩增检测的试剂盒，其进一步包含lamp反应缓冲液和dna聚合酶，和/或反应耗材和说明书。

5.用于猴疱疹病毒实时荧光环介导等温扩增检测的方法，其采用的引物为：

6.根据权利要求5所述的猴疱疹病毒实时荧光环介导等温扩增检测的方法，其包括如下步骤，

7.根据权利要求5-6所述的猴疱疹病毒实时荧光环介导等温扩增检测的方法，其反应体系为：

8.根据权利要求5-7所述的猴疱疹病毒实时荧光环介导等温扩增检测的方法，其扩增程序为：

技术总结
本发明提供了一种用于猴疱疹病毒实时荧光环介导等温扩增检测的LAMP引物，其中，F3引物：5’‑ACGACCTTGCCGACCG‑3’(SEQ ID NO:1)；B3引物：5’‑TTCGTGCCCCTGGAGG‑3’(SEQ ID NO:2)；FIP引物：5’‑GTCATCAAGGCCGACGCGCAGAGGCCCTC GAAGAAGGAGT‑3’(SEQ ID NO:3)；BIP引物5’‑GGA GCGCGTGGAGCTGGTTCGCCAGGAGATCAAGGACAG‑3’(SEQ ID NO:4)；LB引物：5’‑TGTAGTCCAGCAGCC CG‑3’(SEQ ID NO:5)。

技术研发人员：翟云,朱婷,杨玲焰,时长军
受保护的技术使用者：苏州西山生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/6/2