石斑鱼虹彩病毒实时定量PCR检测引物及检测试剂盒

本发明涉及石斑鱼虹彩病毒实时定量pcr检测引物及检测试剂盒，属于石斑鱼虹彩病毒检测。

背景技术：

1、虹彩病毒(iridovirus)是公认的高致病性、高传染性的病毒病原，在石斑鱼、鳜鱼、真鲷、鲈鱼、虹鳟、大黄鱼、大菱鲆等多种淡水和海水养殖鱼类中均有报道，致死率高，造成了严重的经济损失。石斑鱼虹彩病毒(singapore grouper iridovirus,sgiv)最初是从新加坡养殖的患病石斑鱼中分离和鉴定的高致病性虹彩病毒，属于虹彩病毒科(iridoviridae)蛙病毒属(iridovirus)。目前对sgiv尚无较好的治疗手段，主要以预防为主，需及早检测发现。所以，建立快速、准确和高效的石斑鱼虹彩病毒检测方法至关重要。

2、目前，对于sgiv的检测方法主要有组织病理学观察、pcr检测法、lamp检测法、光学显微镜观察、免疫学检测法和酶联免疫吸附试验(elisa)等。但由于组织病理学观察需要在鱼发病过程中进行，需临床症状明显，且人为判断误差较大；常规pcr是病原检测中常用并且操作简单的方法，但是其灵敏度有限，且不能定量检测病毒；免疫学检测操作繁琐、周期长；光学显微镜观察耗时长，准确度小；lamp检测法具有简便、快速和敏感性高等特点，但是操作过程中容易形成气溶胶污染，国内大多数普通实验室不能严格分区，假阳性问题严重，并且引物设计要求高，难以实现绝对定量。

3、实时荧光定量pcr(quantitative real-time pcr，qpcr)技术因其具有快速、灵敏、准确和能够实现定量的特点，在人类、畜禽和水生动物传染病的检测上得到了广泛的应用。赵玉然等发表在《渔业科学进展》2011年第2期111-116页上的文献《真鲷虹彩病毒实时定量pcr检测方法的建立与应用》一文公开了以真鲷虹彩病毒主要衣壳蛋白的保守片段为靶序列，建立了一种针对真鲷虹彩病毒的实时定量pcr检测方法，但未应用于石斑鱼虹彩病毒的检测。

4、发表在《应用微生物学杂志》的文献《环介导等温扩增快速灵敏检测新加坡石斑鱼虹彩病毒》(mao xl,zhou s,xu d,et al.rapid and sensitive detection of singaporegrouper iridovirus by loop-mediated isothermal amplification.j applmicrobiol.2008,105(2):389-97)公开了一种石斑鱼虹彩病毒pcr检测论文中设计的引物序列，但我们研究发现，该引物是针对巨石斑鱼(又名褐点石斑鱼e.tauvina)中sgiv检测的常规pcr引物，在东星斑、斜带石斑鱼和棕点石斑鱼样品的pcr和qpcr检测均会中出现不同程度的非特异性扩增。

5、申请号为200510042129.x的中国发明专利公开了一种用于鱼类虹彩病毒荧光定量pcr检测方法，设计合成了检测的特异性引物和探针，建立了实时定量pcr方法，但探针检测成本较高，且该特异性引物在不同种类石斑鱼sgiv检测中会出现非特异性扩增的问题。

技术实现思路

1、针对以上缺陷，本发明解决的技术问题是提供石斑鱼虹彩病毒实时定量pcr检测引物和检测试剂盒。

2、本发明石斑鱼虹彩病毒实时定量pcr检测引物，其核苷酸序列为：

3、正向引物075r 241-f的核苷酸序列为seq id no.1所示，反向引物075r 241-r的核苷酸序列为seq id no.2所示。

4、本发明基于对不同种类石斑鱼中sgiv的检测，筛选出适用于不同种类石斑鱼的最佳特异性引物，以解决同一引物应用于不同石斑鱼样品时发生非特异性扩增的问题，提高sgiv实时定量pcr检测的准确性和高效性。

5、本发明还提供本发明所述石斑鱼虹彩病毒实时定量pcr检测引物在制备石斑鱼虹彩病毒实时定量pcr检测试剂盒中的应用。

6、本发明还提供一种石斑鱼虹彩病毒实时定量pcr检测试剂盒。

7、本发明石斑鱼虹彩病毒实时定量pcr检测试剂盒，包含上述的石斑鱼虹彩病毒实时定量pcr检测引物。

8、在本发明一个实施方式中，所述试剂盒还包含用于qpcr反应的试剂。

9、本领域常用的qpcr反应的试剂均适用于本发明，包括但不限于市售的sybr greenmaster等。

10、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

11、本发明筛选获得了一对检测石斑鱼虹彩病毒的特异性pcr引物(075r-241)，该引物具有更良好的特异性，可以避免检测sgiv过程中不同种类石斑鱼和其他病原的交叉反应的可能。本发明还利用该对引物构建质粒标准品和并进行了定量检测标准曲线的绘制，建立了sgiv的绝对定量检测。模板应在酶、无菌水、引物之后加入，并且实验于两处独立的空间进行，以减少气溶胶污染而产生假阳性影响结果判断。质粒标准品现配现用，避免反复冻融，减少因模板部分降解而影响标准曲线的线性关系。

技术特征：

1.石斑鱼虹彩病毒实时定量pcr检测引物，其特征在于：其核苷酸序列为：

2.权利要求1所述的石斑鱼虹彩病毒实时定量pcr检测引物在制备石斑鱼虹彩病毒实时定量pcr检测试剂盒中的应用。

3.石斑鱼虹彩病毒实时定量pcr检测试剂盒，其特征在于：包含权利要求1所述的石斑鱼虹彩病毒实时定量pcr检测引物。

4.根据权利要求1所述的石斑鱼虹彩病毒实时定量pcr检测试剂盒，其特征在于：还包含用于qpcr反应的试剂。

技术总结
本发明涉及石斑鱼虹彩病毒实时定量PCR检测引物及检测试剂盒，属于石斑鱼虹彩病毒检测技术领域。本发明解决的技术问题是提供石斑鱼虹彩病毒实时定量PCR检测引物和检测试剂盒。该PCR检测引物的核苷酸序列为：正向引物075R 241‑F的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，反向引物075R 241‑R的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。本发明基于对不同种类石斑鱼中SGIV的检测，筛选出适用于不同种类石斑鱼的最佳特异性引物，该引物具有更良好的特异性，可以避免检测SGIV过程中不同种类石斑鱼和其他病原的交叉反应的可能，提高SGIV实时定量PCR检测的准确性和高效性。

技术研发人员：周永灿,张冬冬,叶小灵,郭家诚,王世锋,郭伟良,邓恒为,蔡岩,李建龙
受保护的技术使用者：海南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13