一种流感病毒裂解疫苗原液的制备方法与流程

本发明涉及流感病毒疫苗领域，特别涉及一种流感病毒裂解疫苗原液的制备方法。

背景技术：

1、流行性感冒病毒，简称流感病毒，是有包膜的rna病毒，属正粘病毒科，主要通过人类谈话时的飞沫、与患有流感的病人的接触或与被流感病毒污染的物品接触而传播。流感病毒包括了人流感病毒和动物流感病毒，而人流感病毒根据病毒核蛋白的抗原性又可以分为甲（a）、乙（b）、丙（c）三种类型，都是流感的病原体。在流感流行期，无论成人还是儿童，通常咳嗽和发热是患流感的基本特征。

2、由于流感病毒非常容易发生变异，会导致流行反复地发生。当出现新毒株，人类免疫水平就会下降，who每年也会根据流感病毒的变异规律推荐出用于下一年疫苗生产用流感病毒毒株，因此每年人们都有必要来接种流感疫苗。

3、在我国，目前广泛使用的是流感病毒在鸡胚尿囊腔中生长的方式来制备流感疫苗（组分包含甲1型、甲3型以及乙型病毒的三价裂解疫苗），采用鸡胚法在鸡胚尿囊腔中接种病毒后，病毒在鸡胚尿囊腔培养过程中，随着胚胎的发育及病毒的大量繁殖会产生大量的尿酸盐。尿酸盐不易溶解，在鸡胚尿囊液中常聚集成丝状或小颗粒型物质，对病毒的纯化造成了较大的影响，进而影响原液制备的批间稳定性。

4、现有去除鸡胚尿囊收获液中尿酸盐的方法主要是将收获液采用过滤或者离心的方式澄清处理后，再通过超滤洗滤的方式去除。尿酸盐沉淀悬浮于收获液中，易被打断成小片段的颗粒。若直接采用过滤法澄清处理，在过滤澄清处理过程中极易堵塞滤孔而导致病毒损失率过大。而采用离心的方式，离心速率过低，不能将小颗粒物质离心下来。而离心速率过大，会加大病毒的损失率，且极易造成批间差异大，质量稳定性差的情况。且试验过程中发现，澄清处理后的尿囊收获液，在超滤浓缩过程中仍会继续析出白色尿酸盐沉淀，造成膜包堵塞，进而导致杂蛋白透过率低，病毒纯度差且回收率低。

技术实现思路

1、针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种流感病毒裂解疫苗原液的制备方法，解决流感病毒疫苗原液制备过程中总体回收率过低、杂蛋白透过率低、病毒纯度差的问题。

2、本发明提供一种流感病毒裂解疫苗原液的制备方法，包括如下步骤：

3、s1：在鸡胚尿囊收获液中加入磷酸二氢钠溶液调节收获液的ph为5.5-6.5；低温孵育后，加入助滤剂，搅拌均匀；此步过滤的目的是去除大量尿酸盐；采用过滤的方式收集滤过液并加入磷酸氢二钠溶液调节滤液ph至7.0-8.0，放置于室温搅拌后，采用超滤浓缩的方法进行浓缩及洗滤，得到浓缩液；

4、s2：浓缩液经超速离心纯化，经超滤洗滤多倍后，除去蔗糖，得到粗纯的病毒液；

5、s3：在粗纯的病毒液中按比例加入β-丙内酯灭活后，进行分子筛层析，即获得精纯的病毒液；

6、s4：在精纯的病毒液中加入裂解剂裂解处理，用来裂解前面灭活好的病毒，在超滤洗滤去除裂解剂并进一步浓缩后，即得到流感病毒裂解疫苗原液。

7、s1中第一步调整的ph值比现有技术要低，维持一个弱酸性环境，便于尿酸盐的析出；第二步调节ph值病毒在ph7.0-8.0比较稳定，故调节至这个范围减少抗原的损失，此步理论上用碳酸钠或碳酸氢钠、0.1m左右的氢氧化钠等弱碱均可，但会引入新的杂质，不利于疫苗的制备。用磷酸氢二钠（弱碱性）和前面的磷酸二氢钠刚好可以中和成ph7.5左右，不会引入新的杂质。s1中采用低ph及低温孵育，并加入助滤剂过滤，去除单价收获液中的尿酸盐，大大提高了疫苗制备的抗原回收率；助滤剂在去除尿酸盐的同时，吸附掉了大部分的色素及部分杂质蛋白，提高了病毒的纯度；利用磷酸氢二钠和磷酸二氢钠酸碱条件温和的特点，进行尿囊收获液ph调节，既可最大程度减少抗原损失，又避免引入其他成分。其他弱酸可以使用，如0.1m左右的醋酸或盐酸，但此类酸会引入杂质，且造成抗原损失较磷酸二氢钠大。灭活一般用甲醛或者β-丙内酯。灭活步骤可以用甲醛代替，但甲醛灭活效率低，残留量高，对机体副作用高，国外已不用。而用β-丙内酯灭活无残留，且灭活效率高。

8、进一步的，所述s1中加入磷酸二氢钠溶液调节收获液的ph为6。

9、进一步的，所述s1中低温孵育的温度为-20℃，静置60分钟。

10、进一步的，所述s1中加入磷酸氢二钠溶液调节滤液ph至7.5。

11、进一步的，所述s1中收获液与助滤剂的用量比为1g/l：3g。

12、进一步的，所述s1中助滤剂为珍珠岩、硅藻土、滑石粉、活性炭中的任意一种。

13、进一步的，所述s2中超速离心的转速为25000rpm-35000rpm，时间为2-4小时。

14、进一步的，所述s2中除去蔗糖的操作为：采用300kd超滤膜包，用pbs洗滤5倍，得到脱糖处理液，取样检测蛋白浓度，用pbs稀释蛋白。

15、进一步的，所述s3中在粗纯的病毒液中按1:4000体积比加入β-丙内酯。

16、进一步的，所述s4中裂解剂为tritonx-100、聚山梨酯80、去氧胆酸钠、tritonn-101、十六烷基三甲基溴化铵中的任意一种。

17、综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：

18、1、采用本发明的制备方法，原液制备总体回收率可达30%以上，而传统方法总体回收率不足20%。

19、2、采用本发明的制备方法，杂蛋白透过率可达99.9%以上。

20、3、采用本发明的制备方法，病毒纯度可达1.87以上。

21、4、采用低ph及低温孵育，并加入硅藻土过滤，去除单价收获液中的尿酸盐，大大提高了疫苗制备的抗原回收率；

22、5、硅藻土在去除尿酸盐的同时，吸附掉了大部分的色素及部分杂质蛋白，提高了病毒的纯度；

23、6、利用磷酸氢二钠和磷酸二氢钠酸碱条件温和的特点，进行尿囊收获液ph调节，既可最大程度减少抗原损失，又避免引入其他成分。

技术特征：

1.一种流感病毒裂解疫苗原液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述s1中加入磷酸二氢钠溶液调节收获液的ph为6。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述s1中低温孵育的温度为-20℃，静置60分钟。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述s1中加入磷酸氢二钠溶液调节滤液ph至7.5。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述s1中收获液与助滤剂的用量比为1g/l：3g。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述s1中助滤剂为珍珠岩、硅藻土、滑石粉、活性炭中的任意一种。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述s2中超速离心的转速为25000rpm-35000rpm，时间为2-4小时。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述s2中除去蔗糖的操作为：采用300kd超滤膜包，用pbs洗滤5倍，得到脱糖处理液，取样检测蛋白浓度，用pbs稀释蛋白。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述s3中在粗纯的病毒液中按1:4000体积比加入β-丙内酯。

10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述s4中裂解剂为tritonx-100、聚山梨酯80、去氧胆酸钠、tritonn-101、十六烷基三甲基溴化铵中的任意一种。

技术总结
本发明公开了一种流感病毒裂解疫苗原液的制备方法，包括以下步骤：S1：在鸡胚尿囊收获液中调节收获液的pH为5.5‑6.5；低温孵育后，加入助滤剂，搅拌均匀；过滤，收集滤过液并调节滤液pH至7.0‑8.0，放置于室温搅拌后，浓缩及洗滤，得到浓缩液；S2：浓缩液经超速离心纯化，经超滤洗滤多倍后，除去蔗糖，得到粗纯的病毒液；S3：在粗纯的病毒液中按比例加入灭活剂后，进行分子筛层析，即获得精纯的病毒液；S4：在精纯的病毒液中加入裂解剂裂解处理，在超滤洗滤去除裂解剂并进一步浓缩后，即得到流感病毒裂解疫苗原液。本发明的制备方法解决了流感病毒疫苗原液制备过程中总体回收率过低、杂蛋白透过率低、病毒纯度差的问题。

技术研发人员：郭土敬,王雪云,罗姗,徐江波,梁琳琳,刘永娣,刘依润,赖婵丹,周珊玄
受保护的技术使用者：深圳市卫光生物制品股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11