副凝聚短状杆菌及其在降解烟叶中多酚类物质方面的应用的制作方法

本发明涉及微生物和生物，尤其涉及一种副凝聚短状杆菌及其在降解烟叶中多酚类物质方面的应用。

背景技术：

1、雪茄是一种具有独特香韵的烟草制品，经过晾晒、农业发酵、堆积发酵、养护醇化等工艺后制得的雪茄样品，有花香、烘焙香、坚果香等复杂香韵。近年来，雪茄产品在国内销售和需求逐渐上升，而国产雪茄在烟叶香气、品质等不及进口雪茄，国产雪茄产业发展受限、工业可用性不高等因素不利于国产雪茄的发展及其在国际市场中的竞争力。

2、目前，在雪茄发酵中已有将酶制剂和微生物菌剂加入烟叶中发酵改善烟叶品质的应用，但关于多酚氧化酶及相关菌株的应用相对较少。已有研究将酚类物质加入葡萄酒发酵后能够增加酯类、萜类等香气物质，多酚物质(包括绿原酸、莨菪葶、芸香苷等)作为影响雪茄烟叶品质的重要物质，其含量过高时会增加烟叶苦味、涩味，影响烟叶口感。因此，绿原酸降解菌株可以作为改善烟叶品质香气的微生物制剂，在雪茄烟叶发酵过程中添加进入，达到减少苦涩味、改善并增加烟叶香气、提升烟叶工业可用性的作用，具有极高的市场潜力与应用前景。

3、目前用于对烟叶进行处理的菌类多属于芽孢杆菌属，比如公开号为cn106579544a的专利文件公开的一种枯草芽孢杆菌xp菌株在降解烟草制品中多酚类物质方面的应用。再比如公开号为cn106434450a的专利文件公开的一种用于降解烟叶中果胶的枯草芽孢杆菌smxp-58菌株及其应用。还未有将副凝聚短状杆菌(brachybacterium paraconglomeratum)用于烟叶中、尤其是用于降解烟叶中多酚类物质的报道。

技术实现思路

1、本发明要解决上述问题，提供一种副凝聚短状杆菌及其在降解烟叶中多酚类物质方面的应用。

2、本发明解决问题的技术方案是，首先提供一种副凝聚短状杆菌，所述副凝聚短状杆菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏单位地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为gdmcc no：63066，保藏日期为2022年12月20日，命名为brachybacteriumparaconglomeratum。

3、本申请发明人从烟叶中筛选出了一种可降解多酚类物质的菌株，并使用细菌通用引物27f和1492r对筛选出的菌株进行菌落pcr，将得到的pcr产物送上海songon公司测序之后，使用blast在ncbi上进行16s rrna序列比对，同源度为99.74％，核苷酸序列如seq idno.1所示，将该菌种经鉴定为副凝聚短状杆菌brachybacterium paraconglomeratum。其在lb琼脂培养基中生长，其菌落特征为：菌落直径为1～2mm，菌落呈黄绿色，形状为圆形，小而突起，表面光滑。

4、现有技术中，副凝聚短状杆菌通常作为微生物饲料发酵剂使用，主要功效如下：补充有益菌，调节动物的微生态平衡；产生有益代谢物，抑制和杀死有害菌；具有营养作用，促进动物生长，提高机体免疫功能。

5、本申请发明人意外地发现，将上述筛选得到的副凝聚短状杆菌用于烟叶中，能有效降解烟叶中多酚类物质，尤其是能有效降解雪茄烟叶中的绿原酸，即产生了本领域技术人员预料不到的技术效果。

6、本发明还有一个目的是提供一种副凝聚短状杆菌在降解烟叶中多酚类物质方面的应用。

7、多酚类物质包括绿原酸、莨菪亭和芸香苷等，本申请的副凝聚短状杆菌对这几种多酚类物质均具有相当的降解作用，对绿原酸的降解效果尤佳。作为本发明的优选，所述多酚类物质为绿原酸。

8、烟叶包括雪茄烟叶和普通卷烟烟叶，值得注意的是，雪茄烟叶与普通卷烟烟叶存在区别：普通卷烟烟叶多为烤烟烟叶，而雪茄烟叶多为晾晒烟叶；雪茄烟叶需要两次或者更多的发酵过程，而卷烟的烟叶则是不需要发酵的。基于处理方式的不同，雪茄烟叶和普通卷烟烟叶的成分存在区别，因而对菌珠株的接受程度也不一样，本申请的副凝聚短状杆菌对于雪茄烟叶中绿原酸的降解效果尤佳。作为本发明的优选，所述烟叶为雪茄烟叶。

9、本申请的副凝聚短状杆菌在发酵条件下降解多酚类物质的效果得到提升，作为本发明的优选，应用时，将包含所述副凝聚短状杆菌的制剂施加于烟叶后进行发酵。

10、其中，制剂中副凝聚短状杆菌的活性浓度、制剂与烟叶的用量比、发酵条件均对具体降解效果存在影响。

11、制剂中副凝聚短状杆菌的活性浓度不应过低，作为本发明的优选，所述制剂中副凝聚短状杆菌的浓度至少为1×108cfu/ml。作为本发明的优选，所述制剂通过以下步骤制备：将所述副凝聚短状杆菌接种于lb液体培养基中，于35℃-40℃、200rpm-240rpm下培养18h-36h。进一步优选地，220rpm下培养。制备制剂时，副凝聚短状杆菌的接种量应该得到控制，过多过少都可能影响副凝聚短状杆菌的活性浓度，作为本发明的优选，所述副凝聚短状杆菌以1.5％-2.5％的接种量接种于lb液体培养基中。进一步优选地，接种量为2％。

12、制剂在烟叶上的用量不应过多或过少，过多造成浪费，过少降解效果不好，作为本发明的优选，所述制剂与烟叶的用量比为(40-50)ml：200g。

13、发酵条件影响副凝聚短状杆菌的作用效果，作为本发明的优选，于温度35℃-39℃、湿度68％-72％下发酵13d-17d。进一步优选地，于温度37℃、湿度70％下发酵15d。

14、本发明的有益效果：

15、本发明提供了一种副凝聚短状杆菌hb001，该菌株应用于烟叶、尤其是雪茄烟叶中，能够有效调节雪茄烟叶多酚物质、尤其是绿原酸的含量，能减轻苦味、涩味等不良口感，同时具有提升烟叶透发性、减轻烟叶杂气、提升甜感、增加烟叶香气质量的作用，提升了烟叶的工业可用性。

技术特征：

1.一种副凝聚短状杆菌，其特征在于：所述副凝聚短状杆菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no：63066，保藏日期为2022年12月20日。

2.如权利要求1所述的一种副凝聚短状杆菌在降解烟叶中多酚类物质方面的应用。

3.如权利要求2所述的一种副凝聚短状杆菌在降解烟叶中多酚类物质方面的应用，其特征在于：所述多酚类物质为绿原酸。

4.如权利要求2所述的一种副凝聚短状杆菌在降解烟叶中多酚类物质方面的应用，其特征在于：所述烟叶为雪茄烟叶。

5.如权利要求2所述的一种副凝聚短状杆菌在降解烟叶中多酚类物质方面的应用，其特征在于：包括以下步骤：将包含所述副凝聚短状杆菌的制剂施加于烟叶后进行发酵。

6.如权利要求5所述的一种副凝聚短状杆菌在降解烟叶中多酚类物质方面的应用，其特征在于：所述制剂中副凝聚短状杆菌的浓度至少为1×108cfu/ml。

7.如权利要求6所述的一种副凝聚短状杆菌在降解烟叶中多酚类物质方面的应用，其特征在于：所述制剂通过以下步骤制备：将所述副凝聚短状杆菌接种于lb液体培养基中，于35℃-40℃、200rpm-240rpm下培养18h-36h。

8.如权利要求7所述的一种副凝聚短状杆菌在降解烟叶中多酚类物质方面的应用，其特征在于：所述副凝聚短状杆菌以1.5％-2.5％的接种量接种于lb液体培养基中。

9.如权利要求6所述的一种副凝聚短状杆菌在降解烟叶中多酚类物质方面的应用，其特征在于：所述制剂与烟叶的用量比为(40-50)ml：200g。

10.如权利要求5所述的一种副凝聚短状杆菌在降解烟叶中多酚类物质方面的应用，其特征在于：于温度35℃-39℃、湿度68％-72％下发酵13d-17d。

技术总结
本发明涉及微生物和生物技术领域，尤其涉及一种副凝聚短状杆菌及其在降解烟叶中多酚类物质方面的应用。这种副凝聚短状杆菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：63066，保藏日期为2022年12月20日。该菌株能够有效调降解雪茄烟叶多酚物质、尤其是绿原酸的含量。

技术研发人员：刘利平,潘勇,李林林,谭再钰,王剑,张娟,吴巧茵
受保护的技术使用者：湖北中烟工业有限责任公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15