一种快速检测伪狂犬病病毒PRV的引物、探针、试剂及方法与流程

本发明涉及伪狂犬病病毒检测，具体为一种快速检测伪狂犬病病毒prv的引物、探针、试剂及方法。

背景技术：

1、伪狂犬病病毒(pseudorabies virus，prv)可感染多种家畜和野生动物，引发以发热、奇痒以及急性脑脊髓炎等为典型神经症状的急性传染病。猪是该病的传染源及长期贮存宿主，该病毒可引起母猪繁殖障碍及仔猪的神经症状、严重的呼吸道疾病，仔猪死亡率较高；耐过猪则生长减缓甚至成僵猪。20世纪70年代以来，中国多采用基因工程缺失疫苗以及与之相配套的血清学鉴别诊断方法以期根除猪伪狂犬病，然而随之也带来了野毒潜伏感染的弊端，导致野毒可长期在机体内复制和向外排毒，从而无法真正地消除猪伪狂犬病。随着规模化养猪的不断发展和强毒株的出现，猪伪狂犬病的发生和流行日趋严重，对该病的防治带来很大的困难，因此对猪伪狂犬病毒感染早期进行及时、快速、准确的诊断，是有效防制该病的重要前提。

2、目前伪狂犬病病毒prv的诊断方法多为传统诊断方法如elisa、血凝试验、普通pcr和病毒分离等方法存在敏感性低、耗时长、假阳性、不能定量等不足，对伪狂犬的早期隐性感染的诊断带来一定难度，而基于pcr的诊断方法耗时长，技术要求高，设备昂贵，无法普及。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种快速检测伪狂犬病病毒prv的引物、探针、试剂及方法，解决了目前elisa、血凝试验、普通pcr和病毒分离等方法存在敏感性低、耗时长、假阳性、不能定量等不足，对伪狂犬的早期隐性感染的诊断带来一定难度，而基于pcr的诊断方法耗时长，技术要求高，设备昂贵，无法普及的问题。

2、为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：本发明提供一种常温等温快速检测伪狂犬病病毒prv的引物和探针，所述引物和探针的序列为：

3、上游引物prv-f1：cgagcaggcctgccccgagtactcgca

4、下游引物prv-r1：gtgaagcggttcgtgatggccgcgtacgtg

5、探针prv-probe：

6、cgccccgcacaagttcaaggcccacatc[fam-dt]a[thf][bhq-dt]acaagaacgtca tcg-3’c3spacer

7、其中，f为荧光基团，h为四氢呋喃，b为淬灭基团，3’末端标记c3间臂。

8、本发明的特异性引物，是针对伪狂犬病病毒prv的设计的寡核苷酸，有两条寡核苷酸组成一对引物，分别特异性识别一个核酸目标物的上下游核苷酸序列；长度在30-35核苷酸(nt)之间，序列中无回文序列、连续单碱基重复序列和内部二级结构区；引物tm值不作为设计时主要考虑因素；最佳引物对需通过试验优化筛选出，其扩增产物为单一条带，无非特异性扩增和明显的引物二聚体。

9、结合图1，荧光基团和粹灭基团之间相距2-4nt，exo是一种核酸外切酶，能够识别thf位点，进行酶切反应，粹灭基团从荧光探针上脱落下来，荧光基团发射的荧光信号得以被检测出，本发明的特异性荧光探针，是针对伪狂犬病病毒prv设计的寡核苷酸长链，寡核苷酸单链专一性识别伪狂犬病病毒prv序列的某一区域，不与特异性引物识别位点重叠，长度为46-52nt，序列避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基；共有四个修饰位点，距离5’端的30-35nt的中部位置标记一个dspacer(四氢呋喃，thf)，作为核酸外切酶的识别位点；thf位点的上游标记一个荧光基团，下游标记一个粹灭基团，两个基团的间距为2-4nt；3’末端标记一个修饰基团，例如胺基、磷酸基团、生物素、或c3-spacer，用于抑制聚合酶从该位点开始延伸；探针的tm值不作为设计的主要考虑因素；荧光基团的种类较多，例如fam、cy3、hex、texasred、joe、vic、tamra或cy5等，淬灭基团可选择bhq1或bhq2，以最大限度地降低背景荧光噪音为原则。

10、本发明还提供一种常温等温快速检测伪狂犬病病毒prv的试剂，包括上述引物和探针。

11、根据本发明的试剂，所述试剂还包括聚乙二醇、tris、乙酸钾、二硫苏糖醇、酸磷酸腺苷、磷酸肌酸二钠盐、磷酸肌酶、脱氧核糖核苷三磷酸、海藻糖、甘露醇、重组酶、单链dna结合蛋白、dna聚合酶、辅助蛋白及核酸外切酶。

12、试剂的制备方法包括：

13、将反应液在-80℃条件下预冻1～1.5小时得到预冻试剂；

14、将预冻试剂先置于-35～-45℃环境下干燥2～10小时，再置于10～18℃环境下干燥1～2小时，得到冻干粉。

15、冻干燥处理，是一种将反应混合物在超低温条件下进行干燥处理的过程，目的是便于反应混合物的存储和运输，减少在长途运输过程中酶活性降低的几率。将反应混合物分装于反应管中，在-80℃条件下预冻60-90分钟，预冻结束后放入真空冷冻干燥机中进行干燥，其过程分为主干燥(-35～-45℃，2-10小时)和终末干燥(10-18℃，1-2小时)两个阶段，两个阶段的干燥时间取决于冻干样品的数量；冷冻干燥后的成品需为白色干性粉末并依附在反应管壁，加水重悬后可完全溶解，无任何颗粒状残留物。

16、试剂中组份的浓度范围如下：

17、重组酶520-725ng/μl；单链dna结合蛋白100-200ng/μl；dna聚合酶350-450ng/μl；核酸外切酶300-400ng/μl。

18、本发明试剂中的4种工程酶分别为重组酶、单链dna结合蛋白、dna聚合酶及辅助蛋白核酸外切酶，是一系列具备特定功能的基因工程酶，它们具有以下特征：(1)每种基因工程酶都来源于自然界常见菌中，具备所需的特定的功能，通过基因工程改造、重组构建、发酵表达、破碎纯化以及活性检测等一系列流程后，变成可工业化生产的高纯度、高活性的酶蛋白；(2)每种酶在扩增反应过程中的作用不同，相互合作在常温恒温的条件下实现核酸的体外快速扩增；(3)重组酶，来源于噬菌体或细菌，例如大肠杆菌(e.coli)重组酶reca；(4)单链dna结合蛋白，来源于t4或e.coli的gp32；(5)dna聚合酶的来源较多，例如phi-29聚合酶、或枯草芽胞杆菌poli(bsu)、bst聚合酶或者e.coli的dna聚合酶iklenow大片段；(6)辅助蛋白，来源于t4噬菌体uvsy蛋白；(7)核酸外切酶，来源于e.coli的核酸外切酶exoiii或exov；(8)每种酶蛋白在反应体系中的最适浓度范围分别为：重组酶的浓度范围是520-725ng/μl；单链dna结合蛋白的浓度范围是100-200ng/μl；dna聚合酶的浓度范围是350-450ng/μl；核酸外切酶的浓度范围是300-400ng/μl。

19、试剂中其余组份的浓度范围如下：

20、试剂中的其它组分，是维持酶促反应最适条件的多种化合物的混合物，(1)这些组分的最适浓度范围分别为：聚乙二醇(peg)，2-4％；tris，20-40mm；乙酸钾(kac)，100-140mm；二硫苏糖醇(dtt)，4-8mm；酸磷酸腺苷(atp)，2-4mm；磷酸肌酸二钠盐(creatinephosphate disodium salt，pcr)，40-60mm；磷酸肌酶(creatine kinase，ck)，80-120ng/μl；脱氧核糖核苷三磷酸(dntp)，250-300μm；海藻糖(trehalose)，5-8％；甘露醇(mannitol)，20-40ng/μl；(2)这些组分为反应提供酶的辅因子、盐离子浓度、酸碱度、反应所需能量、扩增所需原料，冻干处理过程和存储阶段中提供保护剂。

21、本发明还提供一种通过所述试剂实现的常温等温快速检测伪狂犬病病毒prv的检测方法，所述方法包括：

22、在装有所述试剂的反应管中加待检样本、双蒸水和缓冲液；

23、置于一温控设备中孵育15～25分钟，再通过具备荧光检测功能的仪器进行可视化检测，检测过程保持反应管密闭。

24、根据本发所述的方法，所述温控设备保持一恒定温度，且该温度范围为20℃-42℃。

25、本发明检测核酸目标物的方法，是一种在常温等温条件下，通过特异性引物、特异性荧光探针、5种工程酶、其它化学组分的共同作用下，在具备荧光检测功能的仪器中实现核酸目标物的快速检测的方法，通过严格的实验操作步骤保证闭管检测，并有效防止气溶胶污染；适合应用于多种荧光检测设备进行检测。

26、常温等温条件，是指不依赖精确控温的高端精密仪器完成反应的核酸扩增方式。本发明的方法不需要pcr过程中的反复的温度升降，可以在简易的温控设备上实现扩增反应，例如金属浴、水浴或者恒温箱；反应温度可以设置在20-42℃之间；由于反应温度影响着酶的催化速率而与反应速率成一定的相关性，因此对于脱氧核糖核酸(dna)，荧光反应的最佳温度在37-39℃之间。

27、具备荧光检测功能的仪器，指可以同时实时检测多个核酸目标物的荧光信号的设备与平台，具有荧光检测通道，具有加热模块，可以维持反应所需的常温等温条件；还可以具有触屏式或可pc端控制的操作界面，以便实验参数的设置、数据分析以及反应过程的实时观测等一系列操作。

28、本发明的检测方法适合应用于多种荧光检测设备，检测方法的结果可以通过不同类型的荧光检测设备进行判读。待检样本的阳性、阴性判定：以前3分钟内每个样本检测的荧光值的均值计算出样本的标准偏差值，该样本的检测阈值线为前3分钟样本检测荧光均值加上三倍该样本的标准偏差值(单位：荧光强度，mv)；当扩增曲线与阈值线相交后，并在随后的1分钟内曲线斜率大于30mv/分钟，则可视为阳性扩增；如果扩增曲线与该阈值线在反应时间内无任何交点，则视为阴性扩增。

29、本发明的采用闭管检测，一次性加样后，整个检测过程反应管保持密闭，能有效防止气溶胶所引起的假阳性干扰。

30、本发明检测方法的工作原理如图2所示，其是一种借助酶促反应打开核酸物质的高级结构，从而在常温等温条件下进行快速扩增的反应机理。重组酶与引物形成复合物，该复合物在辅助蛋白质的协助下，特异地结合在dna链上；在单链dna结合蛋白的辅助下，模板dna双链结构被打开，单链结核蛋白结合在打开的单链dna上稳定dna单链结构，进而利于重组酶-引物复合物在dna链上搜寻同源互补区域，一旦复合物上的引物找到匹配区域通过碱基互补配对原则结合在dna链上，重组酶从引物上脱落，同时dna聚合酶结合在该区域dna链上，沿着引物的3’端进行子链的延伸；因为dna聚合酶的链置换活性，新合成的子链替代同源母链的位置，与母链形成双链结构；由于上下游引物的限制，重组酶-引物复合物在下一轮扩增起始阶段，大大缩短了扫描匹配区域需要的时间，因而可以更快地合成新的子链；当双链dna被打开之后，特异性荧光探针碱基互补配对结合在引物结合区域的下游的母链上，因此荧光探针嵌入新生成的子链中；在新生成的dna双链中，由于荧光探针的嵌入，在荧光探针的thf区域出现未与母链配对的碱基，核酸外切酶可以识别这些未配对的碱基，进行酶切后将该区域的荧光基团和粹灭基团分离，使荧光基团的荧光信号得以释放，同时切出了3’端的修饰基团，dna聚合酶以此为起点继续延伸子链。新合成的双链dna链上携带有荧光基团，因此荧光检测设备记录的荧光信号与生成子链的数量呈一一对应关系，所以新方法记录的荧光信号也是积累的荧光。

31、有益效果

32、本发明提供了一种快速检测伪狂犬病病毒prv的引物、探针、试剂及方法。与现有技术相比具备以下有益效果：

33、1、常温等温反应：与主要的几种核酸扩增技术相比，常温等温反应大大降低了对仪器加热模块的要求，也减少了对制冷模块的需求，因此使得反应仪器的选择面更加宽广，另外，对于配套检测仪器的设计可以趋于小型化、可携带化和操作简便化发展，而且对于检测操作的要求更加简单、便捷，因此可应用的区域和领域更加广阔。

34、2、反应快速：常温等温核酸扩增技术是利用多种工程酶在特定的溶液环境下，最大限度的模拟生物体内的核酸扩增反应，大大缩短了扩增过程所需的时间，相对于荧光定量pcr，扩增反应时间由1.5-2小时缩短至10-25分钟，明显提高了扩增效率。

35、3、实时检测：与粹灭基团分离的荧光基团和新合成的子链在数量上是一一对应的，随着扩增反应的推进荧光信号是累积的，由于检测仪器采集荧光信号存在一定的时间间隔，因此随着时间的变化，检测的荧光信号是一个变化的过程，从而实现实时监测的效果。

36、4、定性与定量检测：通过采集的荧光信号绘制的扩增曲线可以用于对检测结果的判定，定性检测可以根据扩增曲线的线性快速判断，s型曲线表示阳性样本，平直曲线表示阴性样本；半定量检测可以根据扩增曲线与阈值线相交的时间，初步判断不同待检样本中目标核酸浓度的高低，例如时间值小的样本中目标核酸量高于时间值大的样本中目标核酸量；定性检测可以根据已知浓度的样本绘制标准曲线来实现。

37、5、特异性和灵敏度：每对引物和荧光探针只能与目标核酸物进行特异性结合，因此检测准确而且专一，已有实验数据表明，在25分钟内，对伪狂犬病病毒prv检测的灵敏度都高达1×102拷贝/μl，达到～0.3fg/μl的检测级别。

38、6、检测过程简易：主要反应组分配制后分装至反应管中，并冻干成干粉状态。反应前期准备只需要添加待检样本、双蒸水和缓冲液，混匀后即可启动扩增反应，所以对实验技能要求较低，一般实验人员即可完成操作，扩增反应完成后结果的定性判定也较为简单易懂，根据图形的形状可以作出判断，因此新方法也适合于基层检测机构的推广。

39、7、应用范围广：具有常温、等温、快速、灵敏、特异、操作简便等特点，新方法适用多种荧光检测设备，例如荧光定量pcr、酶标仪、esequant tube scanner、optigene genieiii等，也可适用于将来的微流控分子检测平台。