一种鉴定耐草剂玉米的引物组、试剂盒及其方法与流程

本发明涉及生物，更具体地，涉及鉴定耐草剂玉米的引物组、试剂盒及其方法。

背景技术：

1、玉米是世界上种植最广泛的农作物之一。玉米也是我国种植面积最广的农作物。随着植物基因工程的发展，通过导入外源基因来进行遗传改造成为遗传育种的主要手段之一。抗除草剂玉米可以大幅度降低防治杂草所需要的农业劳动力，降低劳动力的投入，减少杂草对玉米产量的影响。随着人们对健康越来越重视，使得人们越来越关注农作物是否含有转基因成分。am79epsps基因能够赋予植物对除草剂草甘膦的耐受性。插入am79 epsps基因的耐草剂玉米wyn17132是将am79epsps基因根据玉米密码子偏好性特征进行优化，获得的耐除草剂玉米，除草剂耐受性性能优异。

2、根据转基因插入片段的旁侧序列设计转化体特异的检测是目前最为有效的转基因检测方法。常用的转基因植物外源插入载体旁侧序列检测方法包括外源接头介导pcr。但是，该方法循环过程复杂，从而降低了检测效率，并不利于检测。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明提供了一种鉴定耐草剂玉米的引物组、试剂盒及其方法，该方法能够准确能够准确鉴定耐草剂玉米，且检测过程简单，效率高。

2、本发明实施例提供一种鉴定耐草剂玉米的引物组，所述引物组包括：第一引物对和第二引物对中的至少一对，所述第一引物对包括第一引物和第二引物，所述第一引物的序列如序列表中seq id no：1所示，所述第二引物的序列如序列表中seq id no：2所示，所述第二引物对包括第三引物和第四引物，所述第三引物的序列如序列表中seq id no：3所示，所述第四引物的序列如序列表中seq id no：4所示。

3、另一方面，本发明实施例提供了一种鉴定耐草剂玉米的试剂盒，所述试剂盒包括：如权利要求1所述的引物组，所述试剂盒还包括：dna聚合酶和dntp。

4、具体地，所述第一引物、所述第二引物、所述第三引物、所述第四引物的终浓度均为0.25μm。

5、又一方面，本发明实施例提供了一种鉴定耐草剂玉米的方法，所述方法包括：

6、获得待测玉米的基因组dna；

7、将所述基因组dna进行酶切，得到酶切片段；

8、将所述酶切片段进行环化，得到环化基因组dna；

9、以所述环化基因组dna为模板，采用反向pcr引物组进行2轮pcr扩增，得到反向pcr扩增产物；

10、将所述反向pcr产物进行测序，并与参考基因组进行比对，确定外源插入序列的插入位点，确定外源插入序列两侧的旁侧序列；

11、以所述基因组dna为模板，采用测序引物进行扩增，得到pcr扩增产物，将产物测序，验证所述产物序列是否与所述旁侧序列和所述外源插入序列一致；

12、若所述产物序列与所述旁侧序列和所述外源插入序列一致，则根据所述旁侧序列，以所述基因组dna为模板，采用如权利要求1所述的引物组进行扩增，得到pcr产物，将所述pcr产物与所述预期的dna片段进行比对，若所述pcr产物与所述预期的dna片段一致，则鉴定为耐草剂玉米wyn17132。

13、具体地，确定所述预期的dna片段的方法包括：若所述引物组为第一引物和所述第二引物，则所述预期的dna片段为275bp的dna片段。

14、具体地，若所述引物组为所述第三引物和所述第四引物，则所述预期的dna片段为467bp的dna片段。

15、具体地，所述待测玉米为耐除草剂玉米wyn17132。

16、具体地，所述pcr扩增的程序包括35个循环，每个循环均包括：95℃5min，95℃30s，58℃30s，72℃45s，循环结束；然后72℃5min；最后保持在4℃。

17、具体地，所述第一引物、所述第二引物、所述第三引物和所述第四引物的终浓度均为0.25μm。

18、本发明实施例提供了一种鉴定耐草剂玉米的引物组、试剂盒及其方法，可采用反向pcr分离转am79epsps基因耐草剂玉米wyn17132的外源插入片段的旁侧序列，该引物组和试剂盒对检测耐草剂玉米具有较高的灵敏度和特异性，该鉴定方法能够准确鉴定出耐草剂玉米，且检测过程简单，效率高。

19、本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。

技术特征：

1.一种鉴定耐草剂玉米的引物组，其特征在于，所述引物组包括：第一引物对和第二引物对中的至少一对，所述第一引物对包括第一引物和第二引物，所述第一引物的序列如序列表中seq id no：1所示，所述第二引物的序列如序列表中seq id no：2所示，所述第二引物对包括第三引物和第四引物，所述第三引物的序列如序列表中seq id no：3所示，所述第四引物的序列如序列表中seq id no：4所示。

2.一种鉴定耐草剂玉米的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：如权利要求1所述的引物组，所述试剂盒还包括：dna聚合酶和dntp。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述第一引物、所述第二引物、所述第三引物、所述第四引物的终浓度均为0.25μm。

4.一种鉴定耐草剂玉米的方法，其特征在于，所述方法包括：

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，确定所述预期的dna片段的方法包括：若所述引物组为第一引物和所述第二引物，则所述预期的dna片段为275bp的dna片段。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，若所述引物组为所述第三引物和所述第四引物，则所述预期的dna片段为bp的dna片段。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述pcr扩增的程序包括35个循环，每个循环均包括：95℃5min，95℃30s，58℃30s，72℃45s，循环结束；然后72℃5min；最后保持在4℃。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一引物、所述第二引物、所述第三引物和所述第四引物的终浓度均为0.25μm。

技术总结
本发明提供了一种鉴定耐草剂玉米的引物组、试剂盒及其方法。所述引物组包括：第一引物对和第二引物对中的至少一对，所述第一引物对包括第一引物和第二引物，所述第一引物的序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，所述第二引物的序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，所述第二引物对包括第三引物和第四引物，所述第三引物的序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，所述第四引物的序列如序列表中SEQ ID NO：4所示。本发明实施例提供了一种鉴定耐除草剂玉米的引物组、试剂盒及其方法，该引物组和试剂盒对检测耐除草剂玉米具有较高的灵敏度和特异性，该鉴定方法能够准确鉴定出耐除草剂玉米，且检测过程简单，效率高。

技术研发人员：何军光,周骏,楼亿圆,苗昱婷,李焰,任鑫,李静静,张凌燕,任志勇,顾伟航,陆建明
受保护的技术使用者：浙江新安化工集团股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13