用于猪链球菌通用型及2型、7型、9型检测的四重荧光PCR试剂盒的制作方法

本发明涉及猪链球菌多重荧光pcr检测，具体涉及一种用于猪链球菌通用型及2型、7型、9型检测的四重荧光pcr试剂盒。

背景技术：

1、猪链球菌是具有荚膜的一种革兰氏阳性球菌。可根据其细胞壁抗原成分将其大致归类为兰氏分群(lancefieldgroup d)d群链球菌。根据其荚膜抗原(cps)的不同，猪链球菌被分为35(1～34型,1/2型)种血清型,其中1，2，7，9型是猪的致病菌。猪链球菌的定植部位为猪的上呼吸道，尤其是扁桃体和鼻腔。部分血清型的猪链球菌具有致病性，主要通过伤口感染。可引起猪的急性败血症(septicemia with sudden death)、脑膜炎(meningitis)、关节炎(arthritis)、心内膜炎(endocarditis)、肺炎(pneumonia)等疾病。部分菌株可引起人类感染，造成细菌性脑炎(bacterial meningitis)或引起中毒样休克综合征(toxicshock-like syndrome)。

2、目前已有的针对猪链球菌分型的方案，主要包括以下几种：(1)传统分型法：传统的链球菌分型法主要基于糖基化抗原的结构差异，如通过血清凝集反应、免疫印迹等方法，对链球菌进行分型。但这种方法对不同菌株之间的差异鉴定不够敏感，且可能会出现假阳性或假阴性的情况。(2)pcr分型法：pcr技术可以针对不同基因片段进行扩增，从而进行猪链球菌的分型。例如，cps基因、cps2j基因、lyta基因等均可以作为分型的靶标基因。其中cps基因编码链球菌多糖合成的酶，通过cps基因片段扩增，可以将猪链球菌分为不同的血清型。(3)mlst分型法：mlst(multi-locus sequence typing)是一种广泛应用于微生物分子流行病学研究中的分型方法。通过对多个核心基因进行序列分析，确定不同链球菌菌株之间的基因型差异，以此进行分型。(4)全基因组测序：可以获取完整的基因组序列，对菌株进行高分辨率的分型和演化研究，但存在时间长，费用高等问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种用于猪链球菌通用型及2型、7型、9型检测的四重荧光pcr试剂盒，实现猪链球菌病血清型分型检测。

2、本发明提供一种用于猪链球菌通用型及2型、7型、9型检测的四重荧光pcr试剂盒，包括pcr预混合液2×taqpcr mastermix以及用于猪链球菌通用型检测及2型、7型、9型检测的四对特异性引物和探针构成的检测体系，其中：

3、用于猪链球菌通用型检测及2型、7型、9型检测的四对特异性引物以及探针的核苷酸序列如下：

4、

5、其中，所述探针的激发荧光基团选自fam、vic、rox、cy5；所述探针的淬灭基团选自bhq1和bhq2。

6、优选地，所述猪链球菌通用型探针5′端标记的荧光基团为fam，对应的3′端标记的淬灭基团为bhq1；所述猪链球菌2型探针5′端标记的荧光基团为vic，对应的3′端标记的淬灭基团为bhq1；所述猪链球菌7型探针5′端标记的荧光基团为rox，对应的3′端标记的淬灭基团为bhq2；所述猪链球菌9型探针5′端标记的荧光基团为cy5，对应的3′端标记的淬灭基团为bhq2。

7、本发明提供的用于猪链球菌通用型及2型、7型、9型检测的四重荧光pcr试剂盒，包括上述引物探针与2×taqpcr mastermix(pcr预混合液)构成的检测体系，其中，每25μl检测体系中含有streptococcus suis f(猪链球菌正向引物)、streptococcus suis r(猪链球菌反向引物)、serovar 2f(猪链球菌2型正向引物)、serovar 2r(猪链球菌2型反向引物)、serovar 7f(猪链球菌7型正向引物)、serovar 7r(猪链球菌7型反向引物)、serovar9f(猪链球菌9型正向引物)和serovar 9r(猪链球菌9型反向引物)终浓度各为0.2μm；streptococcus suis p(猪链球菌探针)、serovar 2p(猪链球菌2型探针)、serovar 7p(猪链球菌7型探针)和serovar 9p(猪链球菌9型探针)终浓度各为0.05μm，2×taq pcrmastermix(预混反应液)12.5μl，核酸样本5μl。

8、试剂盒的反应程序为：94℃3min；94℃15s，60℃30s(在60℃时收集荧光fam,vic,rox,cy5讯号)45个循环。

9、本发明的有益效果在于：

10、本发明提供的用于猪链球菌通用型及2型、7型、9型检测的四重荧光pcr试剂盒可同时检测猪链球菌及临床中主要流行血清型2、7、9型，操作简单便利，试剂盒特异性好，敏感性高。猪链球菌致病血清型多，且不同血清型之间交叉保护力有限。针对猪链球菌病血清型分型，本发明有效的解决这一问题。

11、本发明通过同时扩增多个不同的靶标序列，可以在同一反应中完成多个检测，具有高效、高灵敏度、高特异性等优点。相较于其他分型方法，本发明方法具有以下优势：

12、(1)高度特异性：本方法可同时扩增多个靶标基因片段，每个靶标片段均针对不同的链球菌亚型，因此具有高度的特异性，可以有效地区分不同的链球菌亚型；

13、(2)高效性：本方法可在同一反应中完成多个检测，省去了单独进行不同靶标片段pcr的步骤，从而大大缩短了检测时间和操作步骤；

14、(3)高灵敏度：本方法利用荧光信号进行检测，可以实现高灵敏度的检测，并且可以定量分析扩增产物的数量，从而实现半定量分析。

技术特征：

1.用于猪链球菌通用型及2型、7型、9型检测的四重荧光pcr试剂盒，其特征在于，包括pcr预混合液2×taqpcr mastermix以及用于检测猪链球菌通用型及2型、7型、9型的四对特异性引物和探针构成的检测体系，其中，

2.根据权利要求1所述的用于猪链球菌通用型及2型、7型、9型检测的四重荧光pcr试剂盒，其特征在于，每25μl检测体系中含有streptococcus suis f、streptococcus suis r、serovar 2f、serovar 2r、serovar 7f、serovar 7r、serovar 9f和serovar 9r终浓度各为0.2μm；streptococcus suis p、serovar 2p、serovar 7p和serovar 9p终浓度各为0.05μm，2×taq pcr mastermix 12.5μl，核酸样本5μl。

3.根据权利要求1所述的用于猪链球菌通用型及2型、7型、9型检测的四重荧光pcr试剂盒，其特征在于，所述探针的激发荧光基团选自fam、vic、rox、cy5。

4.根据权利要求3所述的用于猪链球菌通用型及2型、7型、9型检测的四重荧光pcr试剂盒，其特征在于，所述探针的淬灭基团选自bhq1和bhq2。

5.根据权利要求2所述的用于猪链球菌通用型及2型、7型、9型检测的四重荧光pcr试剂盒，其特征在于，试剂盒的反应程序为：94℃3min；94℃15s，60℃30s 45个循环；在60℃时收集荧光fam,vic,rox,cy5讯号。

6.根据权利要求1～5中任意一项所述的用于猪链球菌通用型及2型、7型、9型检测的四重荧光pcr试剂盒的应用，其特征在于，用于猪链球菌通用型及2型、7型、9型的荧光pcr检测。

技术总结
本发明涉及猪链球菌多重荧光PCR检测技术领域，具体涉及一种用于猪链球菌通用型及2型、7型、9型检测的四重荧光PCR试剂盒。本发明提供的用于猪链球菌通用型及2型、7型、9型检测的四重荧光PCR试剂盒，包括PCR预混合液2×TaqPCR MasterMix以及用于检测猪链球菌及2型、7型、9型的四对特异性引物和探针构成的检测体系，能够实现猪链球菌病血清型分型检测。该试剂盒操作简单便利，试剂盒特异性好，敏感性高。

技术研发人员：柳畅,马玉文豪,贾钦瑞,肖敏,潘廷云,王炎焱
受保护的技术使用者：江西正邦科技股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13