一种唾液联合乳杆菌的核酸检测靶标及方法

本发明涉及微生物的检测技术，具体地说涉及唾液联合乳杆菌的核酸检测靶标和方法。

背景技术：

1、唾液联合乳杆菌(ligilactobacillus salivarius)广泛地存在于人和动物的肠道中。它是革兰氏阳性菌，能代谢低聚果糖产乳酸和乙酸,可在mrs培养基上离体培养,且最佳培养温度为37℃。唾液联合乳杆菌是我国批准使用的食品加工菌种之一，作为一种具有极大潜力的益生性乳杆菌已成为近年研究的热点,并且正在不断被用来制作成适用于人和动物的益生菌制剂。研究表明,乳杆菌或其细胞成分能够改善动物的免疫功能,增强机体的免疫力；唾液联合乳杆菌具有一定的吸附作用,能够很好地在肠道表面定殖生长进而发挥其免疫作用；唾液联合乳杆菌能抑制大肠埃希菌和鼠伤寒沙门氏菌生长,减少病原菌的入侵。肠道内唾液联合乳杆菌在相同的酶促反应和分泌机制下产生的细菌素具有高度多样性,为其在哺乳动物肠道复杂的微生物体系中占据竞争优势提供了前提。另外，唾液联合乳杆菌在生物防治、饲料添加剂及医药方面都有很大的应用潜力。

2、对唾液联合乳杆菌的检测鉴定，一般有细菌培养、生化鉴定和分子生物学的方法。其中常用的分子生物学方法是16s rdna测序。首先采取细菌基因组dna提取试剂盒提取细菌总dna，再采用pcr扩增16s rdna，克隆到质粒载体后测序，最后基因序列上传ncbi，并与genbank中的序列进行对比，根据序列同源性确定种属。可见该方法操作比较繁琐，耗时较长，不能满足快速检测的要求。应用荧光pcr建立唾液联合乳杆菌的快速鉴定方法将能实现菌种的快速、准确鉴定，有助于唾液联合乳杆菌相关产品的生产利用。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种唾液联合乳杆菌的核酸检测靶标及相关检测方法。

2、本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案来实现：

3、1.唾液联合乳杆菌的核酸检测靶基因与靶序列

4、为从设计上提高准确性，本发明通过分析genbank数据库最新的唾液联合乳杆菌核酸序列信息，最终选定在已知的唾液联合乳杆菌中高度保守且与其它物种相似度低的dna-directed rna polymerase subunitα基因作为唾液联合乳杆菌的检测靶基因，具体以该基因中含有以下核酸序列(或其反向互补序列)的区域作为检测靶标：

5、5’-gaatctgaagacagtcaagcattagaaattaatgytactggtccgatggaagtgactgctg gagatatycagagtaatagtgatgtagaagttcttaatccagaacaa-3’(即seq id no.1)。

6、2.唾液联合乳杆菌核酸检测的荧光pcr引物和探针

7、上述唾液联合乳杆菌的检测靶标可用于pcr等核酸检测技术，优选荧光pcr。本发明在上述检测靶序列的适合位置设计出的荧光pcr引物、探针的核酸序列如下：

8、正向引物：5’-gaatctgaagacagtcaagcattagaaa-3’(即seq id no.2)；

9、反向引物：5’-ttgttctggattaagaacttctacatcac-3’(即seq id no.3)；

10、探针：5’-actggtccgatggaagtgactgctgg-3’(即seq id no.4)。

11、该引物、探针的序列在已知的唾液联合乳杆菌的核酸序列中高度保守，且对其它物种具有排他性，从而最大可能地防止了漏检和错检。探针的5’端用荧光报告基团修饰，3’端用荧光淬灭基团修饰。荧光报告基团优选fam，还可以选用hex、tet、joe、rox和cy5中的任意一种；荧光淬灭基团优选bhq1，还可以选用bhq2、bhq3、tamra和eclipse中的任意一种。

12、3.唾液联合乳杆菌荧光pcr检测的反应体系

13、本发明所述的唾液联合乳杆菌荧光pcr检测按表1配成反应体系，反应体积为20μl，可将除核酸样本之外的成分配成2×(即10μl/反应)的预混液保存于-20℃，使用时加水和待测核酸样本至20μl的反应体积即可上机检测。反应体积也可按比例在5μl-100μl范围内扩大或缩小。作为优选，可以在反应体系中添加尿嘧啶-n-糖基化酶(ung)和dutp以防止pcr产物污染可能造成的假阳性结果，进一步保证检测的准确性。

14、表1.唾液联合乳杆菌荧光pcr检测的反应体系

15、

16、

17、*ung和utp为优选成分，两者须一起添加。

18、4.唾液联合乳杆菌荧光pcr检测的反应程序

19、本发明所述的唾液联合乳杆菌荧光pcr检测的反应程序按表2设置，根据探针荧光报告基团设置荧光信号。

20、表2.唾液联合乳杆菌荧光pcr检测试剂反应程序

21、

22、*ung消化步骤仅用于已添加ung和dutp的反应。

23、5.唾液联合乳杆菌荧光pcr定性和定量检测

24、本发明所述的唾液联合乳杆菌荧光pcr检测方法可根据需要实现定量或定性检测。

25、5.1唾液联合乳杆菌荧光pcr定性检测

26、将待测样本与阳性对照品、阴性对照品同时进行荧光pcr检测，反应后检测结果根据以下条件进行判定：(1)阴性对照品无ct且阳性对照品的ct≤30，则实验结果有效，否则结果无效，须排除错误因素后重检；(2)在实验结果有效的前提下，样本ct≤40则报告为唾液联合乳杆菌阳性，样本无ct则报告为唾液联合乳杆菌阴性。

27、5.2唾液联合乳杆菌荧光pcr定量检测

28、将待测样本与一系列已知浓度的定量参考品同时进行荧光pcr检测，根据定量参考品各浓度和ct之间的关系建立标准曲线，将待测样本的ct代入标准曲线计算其浓度。

29、本发明的有益效果：

30、本发明所述的唾液联合乳杆菌核酸检测靶标是通过分析数据库最新的唾液联合乳杆菌核酸序列信息筛选所得，具有高度包容性和特异性，相应的荧光pcr检测方法中使用的引物、探针同样具有良好的包容性、特异性和反应性能，避免漏检(假阴性)和错检(假阳性)的发生；另外，反应体系和反应程序已作优化，从而确保检测准确性。

技术特征：

1.一段可用作唾液联合乳杆菌核酸检测靶标的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列中含有序列seq id no.1或其反向互补序列。

2.一种唾液联合乳杆菌的核酸检测方法，其特征在于，以权利要求1所述的核酸序列作为靶标。

3.权利要求2所述的唾液联合乳杆菌的核酸检测方法，其特征在于，所述核酸检测方法为荧光pcr，反应体系含无核酸酶水、pcr buffer、四种dntp、氯化镁、taq dna聚合酶以及唾液联合乳杆菌的特异性正向引物、反向引物和探针。

4.权利要求3所述的唾液联合乳杆菌的核酸检测方法，其特征在于，所述正向引物的序列为seq id no.2，反向引物的序列为seq id no.3，探针的序列为seq id no.4。

5.权利要求4所述的唾液联合乳杆菌的核酸检测方法，其特征在于，所述探针的5’端用荧光报告基团修饰，3’端用荧光淬灭基团修饰；所述荧光报告基团选用fam、hex、tet、joe、rox和cy5中的任意一种，荧光淬灭基团选用bhq1、bhq2、bhq3、tamra和eclipse中的任意一种。

6.权利要求3、4或5所述的唾液联合乳杆菌的核酸检测方法，其特征在于，反应程序为95℃5min，以95℃10s、60℃30s循环40次。

7.权利要求3、4或5所述的唾液联合乳杆菌的核酸检测方法，其特征在于，所述反应体系中含有尿嘧啶-n-糖基化酶(ung)和dutp，反应程序为50℃5min，95℃5min，以95℃10s、60℃30s循环40次。

8.权利要求3-7任一项所述的唾液联合乳杆菌的核酸检测方法，其特征在于，可用于定性检测，定性检测时将待测样本与阳性对照品、阴性对照品同时进行荧光pcr检测，反应后检测结果根据以下条件进行判定：(1)阴性对照品无ct且阳性对照品的ct≤30，则实验结果有效，否则结果无效，须排除错误因素后重检；(2)在实验结果有效的前提下，样本ct≤40则报告为唾液联合乳杆菌阳性，样本无ct则报告为唾液联合乳杆菌阴性。

9.权利要求3-7任一项所述的唾液联合乳杆菌的核酸检测方法，其特征在于，可用于定量检测，定量检测时将待测样本与一系列已知浓度的定量参考品同时进行荧光pcr检测，根据定量参考品各浓度和ct之间的关系建立标准曲线，将待测样本的ct代入标准曲线计算其浓度。

技术总结
本发明选取在已知的唾液联合乳杆菌中高度保守且与其它物种相似度低的DNA‑directed RNA polymerase subunitα基因作为唾液联合乳杆菌的核酸检测靶基因，具体以该基因中含有序列SEQ ID No.1(或其反向互补序列)的区域作为检测靶标，用于荧光PCR检测。本发明提供的唾液联合乳杆菌荧光PCR检测方法中使用的引物、探针具有良好的包容性、特异性和反应性能，避免漏检(假阴性)和错检(假阳性)的发生；另外，反应体系和反应程序已作优化，从而确保检测准确性。

技术研发人员：黎绍基,李红梅,刘鹭,何诗婷
受保护的技术使用者：广州工商学院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12