一种硫酸盐还原菌活菌的检测方法与流程

本发明属于气田水样检测，具体涉及一种快速检测页岩气田现场水中硫酸盐还原菌活菌浓度的方法。

背景技术：

1、硫酸盐还原菌(srb)广泛存在于生态系统，其代谢过程会导致金属的腐蚀。页岩气开发过程中，srb随返排过程进入生产系统，对井筒和集输系统造成严重的腐蚀破坏。因此，页岩气田需持续开展srb浓度检测，以评估腐蚀风险和评价现场杀菌效果。目前，生产中常用的绝迹稀释法检测周期需7天以上，导致检测效率低下。市面上已形成了一些基于srb检测方法，虽然能够达到快速检测的目的，但是各类方法都存在一定的不足，例如cn103983636b的检测下限高达103cfu/ml以上，cn114317793a和cn105112543b的检测结果中计入了死细胞数目，cn113899721a的检测过程中会产生硫化氢，不利于安全。因此，目前的检测技术均难以满足页岩气开发中的检测需求，有必要形成检测时间不超过1天、检测下限可达到0且能够排除死细菌数量干扰的快速检测方法。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种硫酸盐还原菌活菌的检测方法，该方法具有检测速度快、检测下限低、操作简单的特点。

2、为了达到上述目的，本发明提供了一种硫酸盐还原菌活菌的检测方法，该方法包括以下步骤：

3、(1)建立吸光度与so42-浓度的标准曲线a；

4、(2)配置不同浓度的硫酸盐还原菌菌液，接种至硫酸盐还原菌培养液相同的培养液中进行培养，建立硫酸盐消耗量与硫酸盐还原菌菌液的活菌浓度的标准曲线b；

5、(3)将待测样品接种至与步骤(1)所述硫酸盐还原菌培养液相同的硫酸盐还原菌培养液中进行培养，然后对培养液进行吸光度检测，根据标准曲线a获得培养液的so42-浓度，计算得到硫酸盐的消耗量，根据标准曲线b获得待测样品中的硫酸盐还原菌的活菌浓度；

6、其中，所述硫酸盐还原菌培养液中硫酸盐的浓度在7-10g/l。

7、根据本发明的具体实施方案，优选地，步骤(1)中，采用硫酸钡比浊法来建立吸光度与so42-浓度的标准曲线a。

8、根据本发明的具体实施方案，优选地，所述步骤(1)包括以下具体步骤：取120μl的0.14m氯化钡标准溶液、120μl无水乙醇、40μl的0.1g/l吐温-80加入离心管，共6组，分别加入0、20、40、60、80和100μl的20mm硫酸钠标准溶液，并用ph＝1盐酸补足至1ml；充分混匀后，检测各组溶液于420nm下的吸光度，以so42-浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得到so42-的浓度标准曲线a。吸光度的检测可以利用酶标仪进行。

9、根据本发明的具体实施方案，优选地，所述不同浓度的硫酸盐还原菌菌液的浓度范围为101-107cfu/ml；具体地，所述不同浓度的硫酸盐还原菌菌液的浓度为101cfu/ml、102cfu/ml、103cfu/ml、104cfu/ml、105cfu/ml、106cfu/ml、107cfu/ml。

10、根据本发明的具体实施方案，优选地，所述步骤(2)包括以下具体步骤：对硫酸盐还原菌菌体进行浓度梯度稀释后分别接种到硫酸盐还原菌培养液中培养1天，利用所述标准曲线a结合吸光度的测定，得出so42-消耗量，进而得到so42-消耗量与硫酸盐还原菌浓度的标准曲线b。

11、根据本发明的具体实施方案，优选地，上述浓度梯度稀释的操作包括以下步骤：将测试瓶装满9ml pbs溶液排成一组，依次编上序号；预处理后的细菌菌体样品用无菌注射器取1ml，注入1号瓶内稀释，充分振摇，待用；另一只无菌注射器从1号瓶内抽取1ml经充分振摇后的水样注入2号瓶内稀释充分振摇，待用；再用一只无菌注射器从2号瓶内抽取1ml经充分振摇后的水样注入3号瓶内稀释充分振摇，待用；依次类推稀释直到最后一瓶为止，待用。

12、根据本发明的具体实施方案，优选地，所述步骤(3)中的待测样品的制备过程包括以下具体步骤：

13、对含有硫酸盐还原菌的样品进行离心，收集底部沉淀的硫酸盐还原菌菌体，对硫酸盐还原菌菌体接种到硫酸盐还原菌培养液中培养1天，利用所述标准曲线a结合吸光度的测定，得出so42-消耗量，进而得到so42-消耗量与硫酸盐还原菌浓度的标准曲线b。

14、根据本发明的具体实施方案，优选地，步骤(3)中，所述离心的转速为5000-6000r/min，时间为5-7min。本发明发现离心的转速和时间对于检测结果有很大的影响，如果这两个条件把握不好容易影响效果，只有控制在这里所限定的范围之内才能够满足检测的要求。

15、根据本发明的具体实施方案，优选地，步骤(2)和步骤(3)中，所述培养的方法为：将稀释后的菌液按照1-2％的接种量接种入10％碳源的培养液中，再于28-30℃培养1天。更优选地，所述硫酸盐还原菌培养液为10％碳源的ls4d培养液。

16、根据本发明的具体实施方案，优选地，每升所述硫酸盐还原菌培养液含有7-15ml(例如10ml)维生素溶液，维生素溶液在4℃、n2下避光保存。

17、根据本发明的具体实施方案，优选地，步骤(2)和步骤(3)中所述吸光度的测定是在420nm下进行检测。

18、根据本发明的具体实施方案，优选地，所述待测样品包括但不限于页岩气生产所用的压裂液或进入地面系统的返排液。

19、本发明的有益效果在于：

20、(1)本发明以srb特有的生物特性为原理，能够保证srb检测的特异性，而且因只有具有代谢活性的srb才会引起so42-消耗，所以能够完全排除死细菌数目对结果的干扰；

21、(2)so42-的消耗量能够在1天内得到检测结果，检测时间远少于绝迹稀释法，可达到快速检测的要求；

22、(3)本发明基于srb的代谢过程建立吸光度、so42-浓度和srb活菌浓度间的标准曲线，检测下限可达到0～100cfu/ml，充分满足页岩气现场各类水样的检测需求，尤其是加注杀菌剂后的水样；

23、(4)应用本发明开展srb活菌浓度检测时，只需要进行常规的离心处理、简易的注射稀释操作和利用酶标仪进行简单的吸光度检测，操作简单易行，便于在生产中大规模应用。

技术特征：

1.一种硫酸盐还原菌活菌的检测方法，该方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的检测方法，其中，步骤(1)中，采用硫酸钡比浊法来建立吸光度与so42-浓度的标准曲线a。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其中，所述步骤(1)包括以下具体步骤：

4.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述不同浓度的硫酸盐还原菌菌液的浓度范围为101-107cfu/ml。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其中，所述不同浓度的硫酸盐还原菌菌液的浓度为101cfu/ml、102cfu/ml、103cfu/ml、104cfu/ml、105cfu/ml、106cfu/ml、107cfu/ml。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述步骤(3)中的待测样品的制备过程包括以下具体步骤：

7.根据权利要求6所述的检测方法，其中，所述离心的转速为5000-6000r/min，时间为5-7min。

8.根据权利要求1或6所述的检测方法，其中，步骤(2)和步骤(3)中，所述培养的方法为：将稀释后的菌液按照1-2％的接种量接种入10％碳源的培养液中，再于28-30℃培养1天。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其中，所述硫酸盐还原菌培养液为10％碳源的ls4d培养液。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其中，每升所述硫酸盐还原菌培养液含有7-15ml维生素溶液。

11.根据权利要求1所述的检测方法，其中，步骤(2)和步骤(3)中所述吸光度的测定是在420nm下进行检测。

12.根据权利要求1-11任一项所述的检测方法，其中，所述待测样品为页岩气生产所用的压裂液或进入地面系统的返排液。

技术总结
本发明提供了一种硫酸盐还原菌活菌的检测方法。该检测方法包括以下步骤：(1)建立吸光度与SO<subgt;4</subgt;<supgt;2‑</supgt;浓度的标准曲线A；(2)配置不同浓度的硫酸盐还原菌菌液，接种至硫酸盐还原菌培养液中进行培养，建立硫酸盐消耗量与硫酸盐还原菌菌液的活菌浓度的标准曲线B；(3)将待测样品接种至硫酸盐还原菌培养液中进行培养，然后对培养液进行吸光度检测，根据标准曲线A获得培养液的SO<subgt;4</subgt;<supgt;2‑</supgt;浓度，计算得到硫酸盐的消耗量，根据标准曲线B获得待测样品中的硫酸盐还原菌的活菌浓度。该方法具有检测速度快、检测下限低、操作简单的特点。

技术研发人员：王彦然,于磊,唐永帆,闫静,王智,吴贵阳,曹喜
受保护的技术使用者：中国石油天然气股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/29