百合花青素苷合成调控基因LhWRKY44的克隆及其应用

本发明属于分子生物学和植物工程，具体涉及百合花青素苷合成调控基因lhwrky44的克隆及其应用。

背景技术：

1、百合是百合科(liliaceae)百合属(lilium spp.)多年生草本球根花卉。其栽培历史悠久，花色类型丰富、花色品种繁多。花色是其最重要的观赏性状之一。花青素苷作为百合花色的主要呈色物质，广泛存在于植物的花瓣及果实中，是亚洲百合花被片主要的呈色物质，可导致花被片产生粉红色、紫色等花色类型。花青素苷合成途径是研究得较为透彻的植物次生代谢途径之一。其合成以苯丙氨酸为前体，在内质网上由酶催化关键结构基因合成，如c4h(cinnamate 4-hydroxylase)、chs(chalcone synthase)、chi(chalconeisomerize)、f3h(flavanone 3-hydroxylase)、f3’5’h(flavonoid 3’，5’-hydroxylase)、f3’h(flavonoid 3’-hydroxylase)、dfr(dihydroflavonol 4-reductase)、ans(anthocyanin synthase)、ufgt(udp-glucose:flavonoid-3-o-glucosyltransferase)等结构基因。合成途径基因受到转录水平、转录后水平、表观遗传学水平及环境等多因子的调控，如mbw复合体、dna甲基化、组蛋白修饰等。

2、除此之外，已有的研究表明花青素苷的合成还受hy5、nac、spl、wrky、ap2/erf和hd-zip等转录因子的直接调控。wrky是植物中最大的转录因子家族之一，由一个或两个保守的wrky结构域和一个锌指基序组成。众多的研究显示，wrky家族成员在植物响应胁迫及花青素苷合成方面起到重要的调控作用。前期转录组数据分析及qrt-pcr结果表明，wrky转录因子家族基因wrky44可能在花青素苷积累过程中发挥重要作用。因此，从百合中分离花青素苷合成相关调控基因wrky44并阐明其功能，是研究百合花被片呈色机理的关键环节，必将为开展百合花色调控和花色分子育种奠定理论基础。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种百合花青素苷合成调控基因lhwrky44的克隆及其应用。

2、为了达到上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

3、第一方面，提供一种百合lhwrky44基因，其cdna序列如seq.id.no.1所示。

4、第二方面，提供一种百合lhwrky44基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如seq.id.no.2所示。

5、第三方面，提供一种百合lhwrky44基因的克隆方法，其包括以下步骤：

6、(1)提取百合花被片样本总rna及合成cdna；

7、(2)根据转录组数据设计引物，以cdna为模板，经pcr扩增，获得cds序列，扩增cds序列引物如下：

8、5’端引物：5’-atgcatgactcagaaaagattgctg-3’

9、3’端引物：5’-ttaaccgagctttctctcgttcttg-3’

10、扩增出来的序列经测序验证后与转录组序列对比，获得lhwrky44基因全长1386bp的序列，如seq id no.1所示。

11、第四方面，提供一种重组载体，其含有百合lhwrky44基因。

12、进一步地，根据lhwrky44基因的cds序列，设计接头引物，pcr扩增基因全长序列5’端引物和3’端引物如下：

13、5’-cacgggggactcttgaccatggatgcatgactcagaaaagattgctg-3’

14、5’-ggggaaattcgagctggtcaccttaaccgagctttctctcgttcttg-3’

15、通过pcr扩增，获得带接头的cds序列，利用同源重组的方法，将nco i和bste ii双酶切载体pcambia3301获得的线性载体片段与带接头的cds序列进行重组，最终获得重组载体。

16、第五方面，提供另一种重组载体，其含有百合lhwrky44基因的特异性沉默序列。

17、进一步地，根据所述特异性沉默序列设计接头引物，pcr扩增目的序列5’端引物和3’端引物如下：

18、5′-taaggttaccgaattctctagaaatataagagatcggccttcgtacg-3′

19、5′-gcgtgagctcggtaccggatccagtttgtccttgtgaagctgacga-3′

20、通过pcr扩增，获得带接头的lhwrky44基因的特异性沉默序列，利用同源重组的方法，将xbai和bamhi双酶切载体trv2获得的线性载体片段与带接头的目的序列进行重组，最终获得重组载体。

21、第六方面，提供一种百合lhwrky44基因在控制百合花青素苷合成中的应用。

22、本发明的有益效果为：

23、1.本发明提供的百合lhwrky44基因是百合植株中未知的，参与百合花被片花青素苷合成。

24、2.本发明成功克隆了lhwrky44基因，提供了该基因的核苷酸序列和编码蛋白质氨基酸序列，为百合花色分子育种的种质创制提供理论基础和应用参考价值。

技术特征：

1.一种百合lhwrky44基因，其特征在于，所述百合lhwrky44基因的cdna序列如seq.id.no.1所示。

2.一种权利要求1所述的百合lhwrky44基因编码的蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如seq.id.no.2所示。

3.一种权利要求1所述的百合lhwrky44基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.一种重组载体，其特征在于，含有权利要求1所述的百合lhwrky44基因。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：根据lhwrky44基因的cds序列，设计接头引物，pcr扩增基因全长序列5’端引物和3’端引物如下：5’-cacgggggactcttgaccatggatgcatgactcagaaaagattgctg-3’5’-ggggaaattcgagctggtcaccttaaccgagctttctctcgttcttg-3’通过pcr扩增，获得带接头的cds序列，利用同源重组的方法，将nco i和bste ii双酶切载体pcambia3301获得的线性载体片段与带接头的cds序列进行重组，最终获得重组载体。

6.一种重组载体，其特征在于，含有权利要求1所述的百合lhwrky44基因的特异性沉默序列。

7.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于，根据所述特异性沉默序列设计接头引物，pcr扩增目的序列5’端引物和3’端引物如下：

8.权利要求1所述的百合lhwrky44基因在控制百合花青素苷合成中的应用。

技术总结
本发明公开了一种百合花青素苷合成调控基因LhWRKY44的克隆及其应用，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。在百合中，过表达LhWRKY44后，花青素苷含量升高。VIGS技术诱导内源LhWRKY44基因沉默可显著降低花青素苷含量，表明LhWRKY44在百合花青素苷积累的过程中发挥重要的调控功能。利用本发明提供的LhWRKY44基因来培育百合丰富的花色品种，在百合花色分子育种方面将有广阔的应用前景。

技术研发人员：明军,毕蒙蒙,徐雷锋,杨盼盼
受保护的技术使用者：中国农业科学院蔬菜花卉研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/22