一种多核苷酸、人5型复制缺陷型重组腺病毒、制备方法及预防新型冠状病毒的疫苗

本发明涉及生物，特别涉及一种多核苷酸、人5型复制缺陷型重组腺病毒、制备方法及预防新型冠状病毒的疫苗。

背景技术：

1、到目前为止，已被批准使用的新型冠状病毒感染疫苗超过200种。大多数批准的疫苗被分类为灭活疫苗、腺病毒载体疫苗、基于mrna的疫苗和重组蛋白疫苗。而主要的sars-cov-2结构蛋白是刺突(s)蛋白、核衣壳(n)蛋白、膜(m)蛋白。

2、已有研究表明，刺突蛋白通过受体结合结构域(rbd)与hace2受体结合，这是病毒进入的必要条件。此外，刺突蛋白的c端s2亚基，使用七肽重复序列1 (hr1)和七肽重复序列2 (hr2)，介导病毒包膜和细胞膜之间的连接。且据观察，在感染sars-cov-2或新型冠状病毒感染疫苗后，最重要的中和抗体是针对rbd的，这表明该区域是设计疫苗的良好候选区域。因此，一些研究将rbd作为单一单体抗原，或以二聚体或三聚体形式构建重组新型冠状病毒感染疫苗。然而，尽管rbd疫苗具有较多优点，但其分子尺寸太小可能导致免疫原性差。除了刺突蛋白外，一些研究还将核衣壳(n)蛋白作为免疫原用于疫苗设计。核衣壳(n)蛋白作为冠状病毒中含量最多的结构蛋白，利用交叉反应性t细胞表位，可以增强t细胞应答。虽然这种蛋白质对呼吸系统的病毒感染有轻微的作用，但它通过诱导n特异性t细胞从而杀死感染细胞来控制远端感染的进一步进展，这一作用似乎至关重要。因此，通过连接子连接的多核苷酸表达的rbd蛋白和n蛋白候选疫苗的研发具有一定的前景和意义。

技术实现思路

1、为了克服现有技术存在的缺陷，本发明提供一种多核苷酸、人5型复制缺陷型重组腺病毒、制备方法及预防新型冠状病毒的疫苗。

2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种多核苷酸，所述多核苷酸能够表达截短蛋白，所述截短蛋白包含新型冠状病毒的受体结合结构域rbd和 n蛋白，且多核苷酸的序列如seq id no:2所示。

3、作为进一步的方案，所述多核苷酸为利用基因简并性，通过连接子连接受体结合结构域rbd对应的编码基因和 n蛋白对应的编码基因而得到的优化密码子多核苷酸。

4、作为进一步的方案，所述截短蛋白的氨基酸序列如seq id no:1所示。

5、本发明还公开了一种人5型复制缺陷型重组腺病毒，所述人5型复制缺陷型重组腺病毒负载有上述的多核苷酸。

6、作为进一步的方案，所述人5型复制缺陷型重组腺病毒缺失e1基因和e3基因。

7、本发明还公开了人5型复制缺陷型重组腺病毒的制备方法，所述制备方法用于制备上述的人5型复制缺陷型重组腺病毒，所述制备方法包括以下步骤：

8、（1）对表达截短蛋白的多核苷酸进行优化；

9、（2）合成、扩增和鉴定步骤（1）中所述多核苷酸；

10、（3）构建与鉴定重组腺病毒穿梭质粒；

11、（4）构建与鉴定步骤（3）中所述重组腺病毒穿梭质粒对应的重组腺病毒；

12、（5）扩增、纯化与鉴定步骤（4）中所述重组腺病毒；

13、（6）滴度检测步骤（5）中所得重组腺病毒。

14、本发明还公开了预防新型冠状病毒的疫苗，采用上述人5型复制缺陷型重组腺病毒制备而成。

15、本发明至少具有以下有益效果之一：

16、1、本发明的多核苷酸rbd-n为受体结合结构域rbd对应的编码基因和n蛋白对应的编码基因通过连接子连接融合，通过对多核苷酸rbd-n的优化，可以明显地改善转染细胞的表达，并通过重组腺病毒制备对应的疫苗，制备的疫苗在细胞模型中具有较好的免疫原性，从而解决rbd疫苗分子尺寸太小可能导致免疫原性差的问题。

17、2、本发明所述的制备方法操作简单实用，可在短期内批量生产并用于突发事件。

技术特征：

1.一种多核苷酸，其特征在于：所述多核苷酸能够表达截短蛋白，所述截短蛋白包含新型冠状病毒的受体结合结构域rbd和 n蛋白，且多核苷酸的序列如seq id no:2所示。

2.根据权利要求1所述的一种多核苷酸，其特征在于：所述多核苷酸为利用基因简并性，通过连接子连接受体结合结构域rbd对应的编码基因和 n蛋白对应的编码基因而得到的优化密码子多核苷酸。

3.根据权利要求1所述的一种多核苷酸，其特征在于：所述截短蛋白的氨基酸序列如seq id no:1所示。

4.一种人5型复制缺陷型重组腺病毒，其特征在于：所述人5型复制缺陷型重组腺病毒负载有如权利要求1-3中任一项所述的多核苷酸。

5.根据权利要求4所述的人5型复制缺陷型重组腺病毒，其特征在于：所述人5型复制缺陷型重组腺病毒缺失e1基因和e3基因。

6.人5型复制缺陷型重组腺病毒的制备方法，其特征在于：所述制备方法用于制备如权利要求4~5中任一项所述的人5型复制缺陷型重组腺病毒，所述制备方法包括以下步骤：

7.预防新型冠状病毒的疫苗，其特征在于：采用如权利要求4~6中任一项所述人5型复制缺陷型重组腺病毒制备而成。

技术总结
本发明属于生物技术领域，具体公开了一种多核苷酸、人5型复制缺陷型重组腺病毒、制备方法及预防新型冠状病毒的疫苗，所述多核苷酸能够表达截短蛋白，所述截短蛋白包含新型冠状病毒的受体结合结构域RBD和N蛋白，且多核苷酸的序列如SEQ ID NO:2所示。本发明的多核苷酸RBD‑N为受体结合结构域RBD对应的编码基因和N蛋白对应的编码基因通过连接子连接融合，通过对多核苷酸RBD‑N的优化，可以明显地改善转染细胞的表达，并通过重组腺病毒制备对应的疫苗，制备的疫苗在细胞模型中具有较好的免疫原性，从而解决RBD疫苗分子尺寸太小可能导致免疫原性差的问题。

技术研发人员：李超男,郭艺凯,方仲表,蒋文杰,宋宛宸
受保护的技术使用者：浙江树人学院
技术研发日：
技术公布日：2024/5/12