一种低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物医学，具体涉及一种低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、难愈合创面是糖尿病的严重并发症之一，严重影响着患者的生活质量甚至于生命健康。在这一机体高糖环境下，皮肤作为人体的保护屏障，处于严重的代谢紊乱状态。开发具有潜在应用价值且安全的糖尿病创面愈合治疗方法具有重要价值。

2、外泌体是细胞外分泌的微小囊泡，具有脂质双层膜结构，包含有蛋白质、dna和rna等各种小分子活性成分。外泌体作为旁分泌途径之一，可作为载体将其内容物通过融合细胞膜或者胞吞作用运输至靶细胞内，从而发挥有效生物学效应。相比于药物、小分子材料和干细胞治疗等，干细胞来源的外泌体具有更好的生物安全性和组织相容性。随着愈来愈多的疾病治疗需求，外泌体质量稳定，且适合大规模提取，在临床上应用更加安全。目前应用于糖尿病创面修复的外泌体的效果往往较差。

技术实现思路

1、针对现有技术中的缺陷，本发明的目的在于提供一种低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，所述制备方法能够高效应用于糖尿病创面修复。

2、本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

3、本发明提供了一种低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：

4、将人脐带间充质干细胞在低氧环境中进行培养，得到细胞培养液；所述低氧环境的氧气体积百分含量为0.5％～1.5％；

5、对所述细胞培养液进行外泌体的提取，得到低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体。

6、优选的，所述培养用的培养基包括高糖dmem培养基；所述高糖dmem培养基中含有5％～10％的无外泌体血清。

7、优选的，所述培养的时间为36～48h；所述培养的温度为37℃。

8、优选的，所述提取的步骤包括：

9、将细胞培养液进行低速离心，取上清得到第一悬浮液；

10、将所述第一悬浮液进行中速离心，取上清得到第二悬浮液；

11、将所述第二悬浮液过滤后，进行高速离心，取沉淀进行重悬，再次进行高速离心后再次重悬，得到低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体悬液。

12、优选的，所述低速离心的转速为1000～2000g；所述低速离心的时间为5～10min；

13、所述中速离心的转速为10,000～20,000g；所述中速离心的时间为20～30min；

14、所述高速离心的转速为100,000～200,000g；所述高速离心的时间为75～90min。

15、优选的，所述过滤用滤膜的孔径为0.22μm；所述重悬的试剂包括无菌pbs缓冲液；所述无菌pbs缓冲液的ph为7.2～7.4。

16、优选的，所述人脐带间充质干细胞包括传代2～4次得到的人脐带间充质干细胞。

17、本发明提供了一种上述技术方案所述制备方法制备得到的低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体。

18、本发明提供了上述技术方案所述低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体在制备高mir-17-5p表达的试剂中的应用。

19、本发明还提供了上述技术方案所述低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体在制备促进糖尿病创面愈合药物中的应用。

20、本发明的有益效果：

21、本发明提供了一种低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：将人脐带间充质干细胞在低氧环境中进行培养，得到细胞培养液；所述低氧环境的氧气体积百分含量为0.5％～1.5％；对所述细胞培养液进行外泌体的提取，得到低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体。本发明利用低氧条件制备人脐带间充质干细胞外泌体，所述人脐带间充质干细胞外泌体能够实现mir-17-5p的高表达。实施例结果表明：本发明提供的利用低氧诱导制备外泌体的方法，得到的外泌体用于糖尿病创面，其对糖尿病创面的治疗效果显著优于常氧条件下制备的外泌体，不仅在愈合速度上更具有优势，同时在刺激皮肤附属器再生和提升愈合质量方面具有更大应用潜力。

技术特征：

1.一种低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述培养用的培养基包括高糖dmem培养基；所述高糖dmem培养基中含有5％～10％的无外泌体血清。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述培养的时间为36～48h；所述培养的温度为37℃。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述提取的步骤包括：

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述低速离心的转速为1000～2000g；所述低速离心的时间为5～10min；

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述过滤用滤膜的孔径为0.22μm；所述重悬的试剂包括无菌pbs缓冲液；所述无菌pbs缓冲液的ph为7.2～7.4。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述人脐带间充质干细胞包括传代2～4次得到的人脐带间充质干细胞。

8.权利要求1～7任一项所述制备方法制备得到的低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体。

9.权利要求8所述低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体制备mir-17-5p高表达的试剂。

10.权利要求8所述低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体在制备促进糖尿病创面愈合药物中的应用。

技术总结
本发明提供了一种低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用，属于生物医学技术领域。本发明提供了一种低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，包括：将人脐带间充质干细胞在低氧环境中进行培养，得到细胞培养液；所述低氧环境的氧气体积百分含量为0.5％～1.5％；将培养得到的人脐带间充质干细胞进行差速超速离心，得到低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体。本发明利用低氧诱导制备外泌体的方法得到的外泌体用于糖尿病创面，其对糖尿病创面的治疗效果显著优于常氧条件下制备的外泌体，不仅在愈合速度上更具有优势，同时在刺激皮肤附属器再生和提升愈合质量方面具有更大应用潜力。

技术研发人员：张翠萍,褚自强,张文华,付小兵
受保护的技术使用者：中国人民解放军总医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13