与莲藕节间形状相关的SNP分子标记及其应用

本发明属于分子生物学及作物育种，更具体地说，本发明涉及一种与莲藕节间形状相关的snp分子标记、检测莲藕节间形状相关性状的引物及其应用。

背景技术：

1、莲(nelumbo nucifera gaertn.)又称莲藕，是莲科莲属多年生水生草本植物。莲藕是我国栽培面积最大的水生蔬菜，其主要食用部位是膨大的地下根状茎，即藕。节间形状是藕的重要外观品质，直接影响消费者的喜好和其商品价值，是莲藕育种的主要目标性状。莲藕节间形状主要有短筒形、中筒形和长筒形，节间形状主要由节间长度决定。目前，全国各地的主栽品种以短筒形和中筒形的鄂莲系列品种为主，产量较高，但节间较粗，不适用于生产鲜切藕片等加工产品，且过短的节间会导致藕商品性降低。各地的莲藕地方品种多为长筒形，部分特色品种口感较好，但因产量较低逐渐被淘汰。因此，培育节间形状适宜的高产优质品种已成为莲藕育种的重要方向，但迄今为止控制莲藕节间形状的基因位点还未见报道。因此，挖掘控制莲藕节间形状的基因位点并开发相关分子标记对于莲藕育种具有重要意义。

2、parms(penta-primer amplification refractory mutation system)技术是新开发的一种snp基因分型技术，该技术利用五条引物(一对通用荧光引物、一对等位基因特异引物和一条反向共用引物)对snp或短indel位点进行等位基因特异性扩增，通过荧光扫描进行基因分型。与pcr/re(polymerase chain reaction/restriction enzyme)、page(polyacrylamide gel electrophoresis)等需要电泳基因分型的传统方法相比，parms技术具有操作简便、耗时短和成本低等优势。

技术实现思路

1、本发明首先自鄂莲9号(e9)与山东本地莲藕品种zw2杂交f1代单株自交f2群体中发现莲藕节间形状性状分离，长短节间分离比符合3∶1，然后利用bsa-seq和遗传连锁分析的方法，定位到一个控制莲藕节间形状的隐性基因，定位区间内筛选出一个和基因共分离的snp分子标记，开发了该snp标记的parms引物。上述的标记和引物可以直接用于莲藕节间形状相关性状和相对应的基因型的鉴定，从而在苗期就可以实现从基因型上快速、准确的判断莲藕节间形状相关性状，提高工作效率，为莲藕分子育种提供有效的技术支持。

2、为实现上述目的，采用的技术方案如下：一种与莲藕节间形状相关的snp分子标记，其特征是，所述snp分子标记位于第1号染色体第143127799碱基，该处碱基为a或g。

3、在本发明的一些实施例中，所述snp分子标记的gg基因型对应的莲藕为短节间(属于极短至短节间范围)，所述snp分子标记的aa或ag基因型对应的莲藕为长节间(属于中长至长节间范围)。

4、本发明的另一目的是提供一种检测莲藕节间形状相关性状的parms引物，所述引物可以扩增上述snp分子标记，具体为：

5、引物序列如下，

6、s1-234-f1(seq id no:1)：

7、gaaggtgaccaagttcatgctccctctctgctcccttctatctata；

8、s1-234-f2(seq id no:2)：

9、gaaggtcggagtcaacggattccctctctgctcccttctatctatg；

10、s1-234-r(seq id no:3)：

11、aggaagctattgaacatgcaaagg。

12、本发明还提供了上述snp分子标记、引物在莲藕分子标记辅助育种中的应用。

13、本发明还提供了上述snp分子标记、引物在莲藕节间形状相关性状和相对应的基因型鉴定方面的应用。

14、采用上述的snp分子标记、引物进行莲藕节间形状相关性状和相对应的基因型鉴定的方法，其特征是，

15、(1)以待检测莲藕的dna为模板，利用如seq id no:1-3所示的parms扩增引物进行touchdown pcr扩增，获得扩增产物；

16、(2)pcr产物用quantstudio 5荧光定量pcr仪genotyping模式采集fam和hex荧光信号值，软件自动基因分型后得到清晰直观的基因分型图；

17、(3)在基因分型图中，右下角的分型结果为g:g，对应短节间莲藕样品，中间部分分型结果为a:g，对应长节间莲藕样品；左上角的分型结果为a:a，对应长节间莲藕样品。

18、其中pcr扩增体系(10μl)：5μl 2×parms master mix(包含2条通用荧光引物)，0.15μl10mm s1-234-f1引物，0.15μl 10mm s1-234-f2引物，0.4μl 10mm反向共用引物s1-234-r，0.5μl模板dna，3.8μl ddh2o。pcr反应程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s，65℃(-0.8℃每循环)退火及延伸1min，扩增10个循环；94℃变性20s，57℃退火及延伸1min，扩增28-30个循环。

19、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

20、(1)本发明利用bsa-seq和遗传连锁分析的方法，定位到一个控制莲藕节间形状的snp分子标记，并继而开发了扩增该snp分子标记的parms引物。本发明首次获得了控制莲藕节间形状的基因位点并开发相关分子标记对于莲藕育种具有重要意义。

21、(2)本发明的snp分子标记准确性好，根据snp分子标记和parms引物，可以直接用于莲藕节间形状相关性状和相对应的基因型的鉴定，从而在苗期就可以实现从基因型上快速、准确的判断莲藕节间形状相关性状，提高了工作效率，为莲藕分子育种提供有效的技术支持，具有重要的应用价值。

技术特征：

1.一种与莲藕节间形状相关的snp分子标记，其特征是，所述snp分子标记位于第1号染色体第143127799碱基，该处碱基为a或g。

2.如权利要求1所述的与莲藕节间形状相关的snp分子标记，其特征是，所述snp分子标记的gg基因型对应的莲藕属于极短至短节间范围，所述snp分子标记的aa或ag基因型对应的莲藕属于中长至长节间范围。

3.一种检测莲藕节间形状相关性状的parms引物，所述引物可以扩增权利要求1所述的snp分子标记，所述parms引物具体为：

4.权利要求1所述的snp分子标记和权利要求3所述的parms引物在莲藕分子标记辅助育种中的应用。

5.权利要求1所述的snp分子标记和权利要求3所述的parms引物在莲藕节间形状相关性状和相对应的基因型鉴定方面的应用。

6.权利要求1所述的snp分子标记和权利要求3所述的parms引物进行莲藕节间形状相关性状和相对应的基因型鉴定的方法，其特征是，

7.如权利要求6所述的方法，其特征是，所述pcr扩增体系为：5μl 2×parms mastermix，0.15μl 10mm s1-234-f1引物，0.15μl 10mm s1-234-f2引物，0.4μl 10mm反向共用引物s1-234-r，0.5μl模板dna，3.8μl ddh2o；所述2×parms master mix包含2条通用荧光引物。

8.如权利要求7所述的方法，其特征是，pcr反应程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s，65℃退火及延伸1min，扩增10个循环；94℃变性20s，57℃退火及延伸1min，扩增28-30个循环；其中65℃退火及延伸：-0.8℃每循环。

技术总结
本发明公开了与莲藕节间形状相关的SNP分子标记及其应用，所述SNP分子标记位于第1号染色体第143127799碱基，该处碱基为A或G，扩增上述SNP分子标记的PARMS引物序列如SEQ ID No:1‑3所示。根据SNP分子标记和PARMS引物，可以直接用于莲藕节间形状相关性状和相对应的基因型的鉴定，从而在苗期就可以实现从基因型上快速、准确的判断莲藕节间形状相关性状，提高了工作效率，为莲藕分子育种提供有效的技术支持。

技术研发人员：律文堂,李效尊,吴修,尹静静,徐国鑫
受保护的技术使用者：山东省农业科学院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14