一种铜绿假单胞菌简易定性检测方法

本发明涉及一种铜绿假单胞菌简易定性检测方法，属于环境检测、食品安全及微生物应用。

背景技术：

1、铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)原称绿脓杆菌，在自然界分布广泛，本菌普遍存在，而在潮湿环境尤甚。

2、本菌为条件致病菌，是医院内感染的主要病原菌之一。经常引起术后伤口感染，也可引起褥疮、脓肿、化脓性中耳炎等。本菌引起的感染病灶可导致血行播散，而发生菌血症和败血症。烧伤后感染了铜绿色假单胞菌可造成死亡。该菌通常伴随毒力较强的细菌存在于病灶中，但偶尔也可单独引起暴露于外部的组织感染。感染通常发生于医院内，洗涤槽、防腐溶液和贮尿容器中常可发现这种细菌。通过医护人员可将病菌传给病人，特别在灼伤和新生儿重症监护室。是重要的医院内病原菌。铜绿假单胞菌引起的很多感染发生在衰弱或免疫受损的住院病人，它是重症监护室感染的第二位最常见的病原菌，是呼吸机相关性肺炎的常见原因。铜绿假单胞菌感染可发生于很多解剖部位，包括皮肤、皮下组织、骨、耳、眼、尿路和心脏瓣膜。感染部位与细菌的入口及病人的易感性有关。烧伤时，焦痂下区域可成为大量细菌侵犯的场所，进而成为引起菌血症的病灶，而菌血症常是烧伤的致死性并发症。热带气候条件下常见的外耳炎流脓是耳部铜绿假单胞菌感染最常见的临床类型。糖尿病患者可发生更为严重的恶性外耳炎，表现为严重耳痛常伴有单侧颅神经麻痹，需要肠外给药治疗。

3、由于铜绿假单胞菌在自然界广泛存在，一些食品比如水果、蔬菜也极易受到该菌的污染。而对食品生产环境及食品中铜绿假单胞菌的监测和检测，在食品安全中显得较为重要。

4、目前，用于检测铜绿假单胞菌的检测方法主要是基于铜绿假单胞菌特异性基因序列的pcr(聚合酶链式反应)技术及测序分析技术。该类技术具有灵敏度高、能够定量检测的优势，但是该类技术的普遍应用也具有较大的局限性，因为该类检测技术的应用不仅对操作平台要求特别高包括拥有用于基因扩增的pcr仪器、凝胶成像仪等成本较高的配套设备，而且对操作人员也具有较高的专业素养要求包括对pcr反应后基因片段的生物信息学分析专业知识的熟练掌握。此外，很多情况下，定性检测完全可以满足需求比如感染组织的菌培养、医院环境消毒的效果评价。因此，开发一种对铜绿假单胞菌进行简易定性检测技术较为重要。

技术实现思路

1、本发明的目的之一在于提供一种氨水培养基。

2、本发明所提供的氨水培养基，其配方为：蔗糖50g/l；k2hpo42g/l；nacl2g/l；mgso4.7h2o0.5g/l；feso4.7h2o0.1g/l；1％znso45ml；氨水0.1-10ml/l。

3、本发明的另一目的是提供一种培养基组合。

4、本发明所提供的培养基组合包括上述氨水培养基、lb培养基和pd培养基，其中，所述lb培养基的配方为：蛋白胨10g/l，氯化钠10g/l，酵母提取物5g/l；

5、所述pd培养基的配方为：马铃薯200g/l，葡萄糖10g/l，121℃灭菌20min。

6、上述氨水培养基及培养基组合在铜绿假单胞菌定性检测中的应用也属于本发明的保护范围。

7、本发明的再一目的是提供一种铜绿假单胞菌定性检测方法。

8、本发明所提供的铜绿假单胞菌定性检测方法，包括如下步骤：

9、1)采集样品；

10、2)将采集的样品接种至氨水培养基中培养；

11、3)将所得培养物分别接种至氨水培养基、lb培养基和pd培养基中培养；

12、4)观察步骤3)中各菌液的生长情况及颜色变化，若采用氨水培养基培养的菌液呈白色，采用lb培养基培养的菌液呈绿色，且采用pd培养基培养的菌液呈浅粉红色，则判定所述样品含有铜绿假单胞菌，反之，则判定所述样品不含铜绿假单胞菌。

13、上述方法步骤1)中，所述样品可为液体或固体，若为固体则进行碾碎或粉碎；

14、所述样品可为环境样品，如水、土壤，也可为组织样品，还可为食品。

15、上述方法步骤2)中，样品与氨水培养基的配比可为：1:1000-1:10(单位为g/ml或者ml/ml)；

16、所述培养的条件为：20-35℃,50-200rpm条件下，培养2-5h；

17、上述方法步骤3)中，培养物与氨水培养基、lb培养基或pd培养基的配比均可为：1:1000-1:10(单位为g/ml或者ml/ml)；

18、所述培养的条件为：20-35℃,50-200rpm条件下，培养5-20h。

19、本发明采用氨水培养基预培养结合氨水培养基、lb培养基和pd培养基分别培养，通过判定菌液在氨水培养基、lb培养基和pd培养基中的生长情况及颜色变化来定性检测体系是否含有铜绿假单胞菌，所述方法操作简单，且不需要复杂的仪器，也不要求操作人员必须具备较高的专业素养，具有推广价值。

技术特征：

1.一种氨水培养基，其配方为：蔗糖50g/l；k2hpo42g/l；nacl2g/l；mgso4.7h2o0.5g/l；feso4.7h2o0.1g/l；1％znso45ml；氨水0.1-10ml/l。

2.一种培养基组合，包括权利要求1所述的氨水培养基、lb培养基和pd培养基。

3.根据权利要求2所述的培养基组合，其特征在于：所述lb培养基的配方为：蛋白胨10g/l，氯化钠10g/l，酵母提取物5g/l；

4.权利要求1所述的氨水培养基或权利要求2或3所述的培养基组合在铜绿假单胞菌定性检测中的应用。

5.一种铜绿假单胞菌定性检测方法，包括如下步骤：

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤1)中，所述样品为液体或固体，样品为固体，先进行碾碎或粉碎。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤2)中，样品与氨水培养基的配比为：1:1000-1:10，g/ml或者ml/ml；

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤3)中，培养物与氨水培养基、lb培养基或pd培养基的配比均为：1:1000-1:10，g/ml或者ml/ml；

技术总结
本发明公开了一种铜绿假单胞菌简易定性检测方法。包括如下步骤：1)采集样品；2)将采集的样品接种至氨水培养基中培养；3)将所得培养物分别接种至氨水培养基、LB培养基和PD培养基中培养；4)观察步骤3)中各菌液的生长情况及颜色变化，若采用氨水培养基培养的菌液呈白色，采用LB培养基培养的菌液呈绿色，且采用PD培养基培养的菌液呈浅粉红色，则判定所述样品含有铜绿假单胞菌，反之，则判定所述样品不含铜绿假单胞菌。本发明方法操作简单，且不需要复杂的仪器，也不要求操作人员必须具备较高的专业素养，具有推广价值。

技术研发人员：张殿朋,刘建斌,卢彩鸽,杨俊刚,武凤霞,王甲辰
受保护的技术使用者：北京市农林科学院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13