一种靶向谷胱甘肽过氧化物酶4的纳米抗体及其应用

本发明涉及生物工程，具体涉及一种靶向谷胱甘肽过氧化物酶4的纳米抗体及其应用。

背景技术：

1、铁死亡是近年来发现的一种铁依赖性的，受调控的新型细胞死亡方式，区别于细胞凋亡、坏死等其他形式的细胞死亡。铁死亡是细胞膜上的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化诱导的细胞死亡，受细胞内信号通路的严密调节。谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathioneperoxidase 4,gpx4)是铁死亡的负调节剂，其以谷胱甘肽(gsh)为还原剂催化脂质过氧化物还原成相应的醇，从而阻止脂质过氧化的发生。gpx4处在细胞铁代谢稳态和氧化还原稳态的交叉点上，被证实在铁死亡中起着关键作用。

2、据报道，相比于正常组织，gpx4在肿瘤组织中的表达量明显升高，且被证实是通过调节ros分子来影响肿瘤上皮细胞-间充质转化过程。所以抑制gpx4的活性可以使ros含量增加，从而导致细胞发生铁死亡。研究表明，gpx4的抑制剂可以有效地诱导经药物治疗的癌症耐药株发生铁死亡，而对健康细胞无明显影响，故gpx4现已成为解决肿瘤耐药问题的重要药物靶点。

3、纳米抗体(nanobody，nb)是一种新型的基因工程抗体。1993年比利时科学家在双峰驼科动物身上发现了天然缺失轻链的重链抗体，后来人们通过基因工程技术表达出这种重链抗体的抗原结合区，这种单个结构域的重链抗体片段是目前人们通过基因工程手段制备出的具有抗原识别与结合能力的最小抗体片段，其分子量大小只有15kd左右，仅为传统抗体的十分之一。纳米抗体长方体的结构特点会暴露出与抗原结合的突出表位，这使它们更易于靶向传统抗体无法接触到的受体间隙或结合口袋。这种新型抗体具有低免疫原性、高稳定性、高亲和力、高特异性等特点。

技术实现思路

1、本发明提供了一种靶向谷胱甘肽过氧化物酶4的纳米抗体及其应用。本发明利用噬菌体展示技术得到一种靶向谷胱甘肽过氧化物酶4(gpx4)纳米抗体，所述纳米抗体具有较高的检测灵敏度、特异性，也具有作为肿瘤治疗药物的潜力。

2、为了实现上述目的，本发明通过以下方案予以实现的：

3、本发明提供了一种靶向谷胱甘肽过氧化物酶4的纳米抗体，其具有如seq id no.1～seq id no.4、seq id no.9～seq id no.14其中之一所示的氨基酸序列。

4、优选的，所述纳米抗体具体为氨基酸序列分别如seq id no.9～seq id no.14所示的纳米抗体nb-gpx4-12e、nb-gpx4-4c、nb-gpx4-5c、nb-gpx4-5f、nb-gpx4-12e-cpp和nb-gpx4-4c-cpp。

5、本发明还提供了一种所述的纳米抗体的编码基因，其具有如seq id no.5～seqid no.8、seq id no.15、seq id no.16其中之一所示的核苷酸序列，其分别编码的是如seqid no.1～seq id no.4、seq id no.13、seq id no.14所示的氨基酸序列。

6、本发明还提供了一种重组载体，其中含有所述的编码基因。

7、优选的，所述载体为pcomb3xss。

8、本发明还提供了一种重组细胞，其中含有所述的编码基因。

9、优选的，所述重组细胞为大肠杆菌细胞。

10、本发明还提供了所述的纳米抗体、所述的编码基因、所述的重组载体、或者所述的重组细胞在制备谷胱甘肽过氧化物酶4特异性检测试剂中的应用。

11、进一步的，所述纳米抗体检测谷胱甘肽过氧化物酶4的检测限不小于1.15nm。

12、本发明还提供了一种用于检测谷胱甘肽过氧化物酶4的试剂盒，其中含有所述的纳米抗体。

13、进一步的，所述试剂盒中还包括酶标二抗、显色剂和终止剂。

14、优选的，所述纳米抗体采用的是nb-gpx4-12e、nb-gpx4-4c、nb-gpx4-5c和nb-gpx4-5f。

15、本发明还提供了所述的纳米抗体在制备抗肿瘤的药物中的应用。

16、进一步的，所述纳米抗体nb-gpx4-12e-cpp通过靶向谷胱甘肽过氧化物酶4诱发肿瘤细胞的铁死亡，达到抗肿瘤的作用。

17、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

18、本发明首先免疫双峰驼，而后利用免疫后的双峰驼淋巴细胞建立抗体基因文库，此抗体基因文库纳米抗体基因多样性好，再用噬菌体展示技术，将检测抗原固相包被于酶标板上，投入双峰驼免疫抗体文库进行亲和淘筛，获得靶向gpx4的纳米抗体。所述纳米抗体具有较高的检测灵敏度、特异性与热稳定性，能够在常温条件下长时间运输、储存与使用，且操作简单、所耗时间较短，可通过基因工程重组表达的方式即将编码该纳米抗体的基因克隆至表达载体，以蛋白表达的形式进行所述纳米抗体的大量制备。并且，所述纳米抗体在gpx4的快速有效检测中具有良好的应用前景和广阔的发展空间，本发明制备纳米抗体的方法具有普遍适用性，可用于其他药物蛋白靶点纳米抗体的筛选和制备，具有较高的应用价值。除此之外，本发明提供的纳米抗体可以在细胞内特异性结合gpx4并诱导肿瘤细胞发生铁死亡，显示了其在抗肿瘤药物领域的应用前景。

技术特征：

1.一种靶向谷胱甘肽过氧化物酶4的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体具有如seqid no.1～seq id no.4、seq id no.9～seq id no.14其中之一所示的氨基酸序列。

2.一种靶向谷胱甘肽过氧化物酶4的纳米抗体的编码基因，其特征在于，所述编码基因具有如seq id no.5～seq id no.8、seq id no.15、seq id no.16其中之一所示的核苷酸序列。

3.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体中含有权利要求2所述的编码基因。

4.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞中含有权利要求2所述的编码基因。

5.权利要求1所述的纳米抗体、权利要求2所述的编码基因、权利要求3所述的重组载体、或者权利要求4所述的重组细胞在制备谷胱甘肽过氧化物酶4特异性检测试剂中的应用。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述纳米抗体检测谷胱甘肽过氧化物酶4的检测限不小于1.15nm。

7.一种用于检测谷胱甘肽过氧化物酶4的试剂盒，其特征在于，其中含有权利要求1所述的纳米抗体。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括酶标二抗、显色剂和终止剂。

9.权利要求1所述的纳米抗体在制备抗肿瘤的药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述纳米抗体通过靶向谷胱甘肽过氧化物酶4诱发肿瘤细胞的铁死亡，达到抗肿瘤的作用。

技术总结
本发明公开了一种靶向谷胱甘肽过氧化物酶4的纳米抗体及其应用。所述纳米抗体具有如SEQ ID No.1～SEQ ID No.4、SEQ ID No.9～SEQ ID No.14其中之一所示的氨基酸序列。所述纳米抗体特异性强、耐高温、耐酸碱、易保存，且生产成本低，生产周期短，能够作为谷胱甘肽过氧化物酶4的特异性检测试剂，并且可以通过靶向谷胱甘肽过氧化物酶4成功诱发肿瘤细胞铁死亡，具有良好的应用前景和广阔的发展空间。

技术研发人员：邱雪,徐振林,王勇,李鑫雨,李亚茹
受保护的技术使用者：中国海洋大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14