共表达蔗糖磷酸化酶和透明颤菌血红蛋白的工程菌及应用

本发明涉及基因工程，具体涉及一种共表达蔗糖磷酸化酶和透明颤菌血红蛋白的工程菌。

背景技术：

1、蔗糖磷酸化酶(ec 2.4.1.7，简称spase)是一种转糖苷酶，属于糖基水解酶13家族。该酶已广泛应用于食品、化妆品、医药等行业，例如：利用spase催化合成甘油葡萄糖苷和α-熊果苷等保湿或美白类产品，当今国内外市场对该酶的需求逐年扩大。由于不同菌株产生的蔗糖磷酸化酶的分子结构和催化性能不同，其底物的特异性差异较大。虽然不同来源的蔗糖磷酸化酶会有一定的底物特异性差异，但该酶普遍具有两种主要的催化反应类型，即：1、将葡萄糖基从葡萄糖-1-磷酸转移至相应的受体上；2、将蔗糖水解并可将葡萄糖基转移至相应的受体，受体可以为水、无机磷酸以及含酚羟基、醇羟基或羧基等有机物，例如以氢醌等为受体可合成熊果苷。在国外，特别是在日本和韩国等国家，已较为系统的研究了基因工程菌表达并产生蔗糖磷酸化酶的方法，但在我国大多数的研究仍停留在野生菌的筛选和产酶条件优化等方面。由于我国产酶工艺的高成本以及缺乏对该酶在分子水平上的了解和研究，该酶目前主要依赖进口。

2、在利用重组大肠杆菌有氧发酵生产蔗糖磷酸化酶的过程中，保持充足的氧气供应是最困难的工程问题；特别是当菌体浓度较高时，发酵罐内溶解氧的指示参数do值常接近于零，表明氧气严重匮乏，为了满足生产过程中的高需氧量必须通过分子生物学手段给予解决方案。透明颤菌(vitreoscilla)是一种专性好氧的革兰氏阴性丝状菌，习惯生长于泥塘腐叶等高度贫氧的环境中，并能诱导合成一种可溶性的血红素蛋白，即透明颤菌血红蛋白(vitreoscilla hemoglobin，vhb)。透明颤菌血红蛋白是由两个分子量为15.8kda的亚基和两个b型血红素构成的同型二聚体。蛋白纯化研究表明，当蛋白质浓度为10g/l时，大部分vhb被洗脱，总分子量为29kda，表明vhb处于二聚体状态；当vhb在较低的蛋白质浓度下，总分子量为15kda，表明vhb处于单体状态。在大肠杆菌中，透明颤菌血红蛋白vhb是一种跨膜蛋白，它捕获o2并将其转移到末端氧化酶。虽然vhb的o2结合速率常数与其他血红蛋白相似，但vhb的o2解离速率常数要高得多，这表明vhb可以非常有效地将o2输送到细胞色素上，从而增强有氧呼吸。在大肠杆菌中共表达目的蛋白和vhb是改善发酵过程溶氧不足、增强细胞生长和外源蛋白产量的有效手段，且vhb应用于发酵工业，可提高产量和降低能耗，又不需要额外设备投资。本发明的目的即在于通过引入透明颤菌血红蛋白vhb来提升重组大肠杆菌的发酵产酶能力，降低蔗糖磷酸化酶的发酵制备成本，为其大规模应用奠定基础。

技术实现思路

1、为克服现有技术的不足，本发明提出一种共表达蔗糖磷酸化酶和透明颤菌血红蛋白的工程菌，能够有效提升发酵液的酶活。

2、为实现上述目的，一种共表达蔗糖磷酸化酶和透明颤菌血红蛋白的工程菌，以pet系列质粒为载体，以大肠杆菌为宿主将来源于肠膜明串珠菌(leuconostocmesenteroides)的蔗糖磷酸化酶基因(lmsp2基因)与透明颤菌血红蛋白基因(vgb基因)异源共表达。

3、进一步地，编码蔗糖磷酸化酶的基因序列如seq id no.1所示，编码透明颤菌血红蛋白的基因序列如seq id no.2所示。

4、进一步地，共表达蔗糖磷酸化酶和透明颤菌血红蛋白的工程菌按如下方法构建：将seq id no.1所示基因、seq id no.2所示基因与载体连接，转化至大肠杆菌感受态细胞中。

5、进一步地，采用优化后的sd序列，降低透明颤菌血红蛋白的表达量。

6、进一步地，将seq id no.2所示基因上游t7启动子更换为plac启动子，降低透明颤菌血红蛋白的表达量。

7、进一步地，大肠杆菌包括e.coli bl21(de3)、e.coli dh5α。

8、本发明还提出一种共表达蔗糖磷酸化酶和透明颤菌血红蛋白的工程菌在制备蔗糖磷酸化酶中的应用。

9、进一步地，共表达蔗糖磷酸化酶和透明颤菌血红蛋白的工程菌接种至培养基中，于37℃培养3h，采用终浓度为0.5mm的iptg，在25℃下诱导培养20h得发酵液。

10、进一步地，将诱导后的发酵液于4℃、8000rpm离心5min，弃上清，收集菌体，菌体沉淀用双蒸水重新悬浮，混匀，用超声波细胞破碎仪破碎菌体悬浮液的细胞壁，然后12000rpm离心1min，离心后上清即为发酵胞内粗酶液。

11、本发明的构建得到的重组大肠杆菌发酵生产重组蔗糖磷酸化酶和透明颤菌血红蛋白，发酵液酶活约为2.16u·ml-1，较单独异源表达蔗糖磷酸化酶基因的重组大肠杆菌发酵液酶活提高近66％，可在制备食品、药品、保健品、化妆品中推广应用。

技术特征：

1.一种共表达蔗糖磷酸化酶和透明颤菌血红蛋白的工程菌，其特征在于，以pet系列质粒为载体，以大肠杆菌为宿主将来源于肠膜明串珠菌(leuconostoc

2.根据权利要求1所述的共表达蔗糖磷酸化酶和透明颤菌血红蛋白的工程菌，其特征在于，编码所述蔗糖磷酸化酶的基因序列如seq id no.1所示，编码所述透明颤菌血红蛋白的基因序列如seq id no.2所示。

3.根据权利要求2所述的共表达蔗糖磷酸化酶和透明颤菌血红蛋白的工程菌，其特征在于，所述共表达蔗糖磷酸化酶和透明颤菌血红蛋白的工程菌按如下方法构建：将seq idno.1所示基因、seq id no.2所示基因与载体连接，转化至大肠杆菌感受态细胞中。

4.根据权利要求3所述的共表达蔗糖磷酸化酶和透明颤菌血红蛋白的工程菌，其特征在于，采用优化后的sd序列，降低透明颤菌血红蛋白的表达量。

5.根据权利要求3所述的共表达蔗糖磷酸化酶和透明颤菌血红蛋白的工程菌，其特征在于，将seq id no.2所示基因上游t7启动子更换为plac启动子，降低透明颤菌血红蛋白的表达量。

6.根据权利要求1所述的共表达蔗糖磷酸化酶和透明颤菌血红蛋白的工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌包括e.colibl21(de3)、e.colidh5α。

7.一种权利要求1所述共表达蔗糖磷酸化酶和透明颤菌血红蛋白的工程菌在制备蔗糖磷酸化酶中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将权利要求1所述共表达蔗糖磷酸化酶和透明颤菌血红蛋白的工程菌接种至培养基中，于37℃培养3h，采用终浓度为0.5mm的iptg，在25℃下诱导培养20h得发酵液。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将诱导后的发酵液于4℃、8000rpm离心5min，弃上清，收集菌体，菌体沉淀用双蒸水重新悬浮，混匀，用超声波细胞破碎仪破碎菌体悬浮液的细胞壁，然后12000rpm离心1min，离心后上清即为发酵胞内粗酶液。

技术总结
本发明提出一种共表达蔗糖磷酸化酶和透明颤菌血红蛋白的工程菌，以pET系列质粒为载体，以大肠杆菌为宿主将来源于肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)的蔗糖磷酸化酶基因(LmSP2基因)与透明颤菌血红蛋白基因(vgb基因)异源共表达。该工程菌较单独异源表达蔗糖磷酸化酶基因的重组大肠杆菌发酵液酶活提高近66％。本发明还提出该工程菌在制备蔗糖磷酸化酶中的应用。

技术研发人员：徐铮,韩子钰,李娜,严赛峰
受保护的技术使用者：南京工业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14