一种提高粟酒裂殖酵母有机酸耐受性的方法

：本发明属于生物工程，涉及一种提高粟酒裂殖酵母对乙酸、乳酸或其他有机酸耐受性的方法。

背景技术

0、
背景技术：

1、酵母菌因具有生命力顽强、繁殖速度快、生长周期短、培养条件简单等优良特点，被广泛用于酒类酿造、调味品酿造等传统发酵工业和新兴绿色生物制造业中。在其发酵过程中，生物转化率时常会受到外界环境变化和自身代谢失衡引起的多种胁迫因子的限制，如弱有机酸、高温、高渗等。乙酸和乳酸是两种常见的有机酸胁迫因子。例如，白酒固态发酵体系中，乳酸菌等微生物代谢产生乙酸、乳酸，造成酒醅环境酸化；生物燃料乙醇生产过程中，纤维素预处理阶段衍生大量的乙酸，成为影响微生物细胞工厂的关键抑制物。如何增强底盘微生物的鲁棒性，减轻有机酸胁迫对微生物的抑制力，是改善微生物的发酵性能和提升生物转化率的重要挑战。

2、胞内氧化还原失衡是有机酸抑制微生物生长代谢的主要表现方式之一。当采用大于0.2％v/v的乙酸处理酿酒酵母，即引起内质网中错误折叠蛋白聚集，触发内质网应激反应。在此状态下，定位于内质网的氧化酶ero1被激活并产生ros。长时间的内质网应激则会引起细胞质中钙离子含量的上调，促进细胞色素c的释放以及线粒体跨膜电位(mitochondrial membrane potential,δψm)的下降。不仅如此，采用高浓度乙酸对酵母菌胁迫时，胞内h2o2水平迅速增高并在15min内达到峰值(产生的机制尚不清楚)。h2o2水平的增高引起线粒体呼吸链功能障碍以及乌头酸酶的失活，胞内氧化胁迫压力不断增大。

3、细胞中ros过度积累一方面使得蛋白质部分三级结构发生变化，肽链发生断裂或形成蛋白质交联聚合物，从而引起蛋白质功能丧失。另一方面，自由基与细胞膜中不饱和脂肪酸发生反应形成脂质过氧化自由基，从而对细胞膜的完整性造成损伤。此外，ros还可以通过产生的羟自由基直接攻击dna，使其双链发生断裂从而对核酸造成氧化损伤。

4、酵母细胞在长期进化中，已经形成以抗氧化酶防御和非酶系防御为主的抗氧化系统，可以持续性地消除胞内产生的ros，使之达到一种平衡状态，来维持细胞内环境的稳定。酵母细胞内的抗氧化酶防御系统主要包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，sod)、过氧化氢酶(catalase，cat)、谷胱甘肽还原酶/谷胱甘肽氧化物酶系(glutaredoxinsystem，gsh)以及硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin system，trx)等。酵母细胞非酶防御系统主要由其自身合成的一些能够清除自由基的小分子代谢产物组成，包括谷胱甘肽、脂肪酸、维生素、氨基酸衍生物、糖类和一些具有缓冲作用的离子。

5、鉴于氧化程度提升是有机酸胁迫主要作用方式之一，通过提升菌株的抗氧化性能来间接提高菌株耐受乙酸、乳酸等有机酸的能力或许是有效可行的途径。参与细胞氧化胁迫响应的途径或元件有很多，如ros清除相关基因ctt1、cat1、tsa1、prx1、dot5等。尽管这些基因编码的蛋白都可以减少由超氧化物歧化酶形成的h2o2，但这些元件对细胞耐酸性能的影响却并不相同，cat1和ctt1的表达水平提高有利于提升细胞的耐酸特性(fems yeastres,2016,16(2):fow010.)，而tsa1的缺失同样可以提高细胞对低ph的耐受性(j biolchem,2000,275(8):5723-32)。由此可见，ros清除相关途径或是催化元件与细胞耐酸性能之间关联关系不可预见。

技术实现思路

0、
技术实现要素：

1、本发明的目的在于提供一种提高粟酒裂殖酵母耐受有机酸的方法，从而提高酵母在乙酸、乳酸等有机酸胁迫下的生长生产性能。

2、本发明第一方面，提供了一种提高粟酒裂殖酵母耐受乙酸、耐受乳酸的方法，通过强化粟酒裂殖酵母中参与过氧化氢分解相关基因的表达，从而提高粟酒裂殖酵母对乙酸、乳酸等有机酸的耐受能力；

3、进一步地，所述参与过氧化氢分解相关基因包括但不限于trx1、tpx1和pmp20。

4、本发明第二方面，提供了一种高耐受乙酸、乳酸的重组菌株，所述重组菌株是通过强化参与过氧化氢分解相关基因在粟酒裂殖酵母宿主中的表达获得的；

5、进一步地，所述的参与过氧化氢分解相关基因包括trx1、tpx1和pmp20；

6、更进一步地，所述trx1基因，核苷酸序列如序列表seq id no：1所示；

7、更进一步地，所述tpx1基因，核苷酸序列如序列表seq id no：2所示；

8、更进一步地，所述pmp20基因，核苷酸序列如序列表seq id no：3所示；

9、进一步地，所述强化包括过通过过表达的方式上调所述的参与过氧化氢分解相关基因的表达。

10、优选地，所述粟酒裂殖酵母宿主为粟酒裂殖酵母sp.65，保藏编号cgmccno.21792，以粟酒裂殖酵母sp.65为出发菌株，通过整合过表达提高trx1、tpx1或pmp20的表达量，获得一株高耐受乙酸、乳酸的重组菌株。

11、进一步地，所述重组菌株的构建包括以下步骤(以过表达trx1为例)：

12、(1)重组片段的获得

13、以cgmcc no.21792基因组为模板分别扩增pku70位点上同源臂、eno101启动子、基因trx1编码区、nmt1终止子、pku70位点下同源臂；以质粒pug16为模板扩增kanmx作为筛选标记；纯化回收后备用。

14、(2)trx1过表达盒的构建

15、通过融合pcr将eno101启动子、基因trx1编码区、nmt1终止子融合成一个片段，作为trx1基因的过表达盒。

16、(3)重组片段导入酵母

17、基于同源重组原理，通过醋酸锂化学转化法将重组片段导入到出发菌株sp.65中，选择pku70作为过表达位点。

18、本发明第三方面，提供了一种上述高耐受乙酸、乳酸的重组菌株的应用，特别是在生物燃料乙醇高效转化、白酒等酒精饮料生产中的应用。

19、本发明方法的应用是广泛的，其为有效提升粟酒裂殖酵母对于乙酸、乳酸等有机酸的耐受性提供了新思路。

20、本发明的有益成果是：

21、1、本发明提供通过在粟酒裂殖酵中过表达基因trx1、tpx1或pmp20显著提升了菌株对乙酸和乳酸的耐受性能。

22、2、本发明所述的粟酒裂殖酵母重组菌株::trx1、::tpx1、::pmp20，在8g/l乙酸和35g/l乳酸双重酸胁迫条件下，经148h发酵后，相比野生型菌株，乙醇产量分别提升11％、18％和35％，增加了菌株在酸胁迫下的乙醇产生效率。

技术特征：

1.一种提高粟酒裂殖酵母耐受乙酸、耐受乳酸的方法，其特征在于，通过强化粟酒裂殖酵母中参与过氧化氢分解相关基因的表达，从而提高粟酒裂殖酵母对乙酸、乳酸等有机酸的耐受能力；

2.一种耐受乙酸、乳酸的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株是通过强化参与过氧化氢分解相关基因在粟酒裂殖酵母宿主中的表达获得的；

3.如权利要求2所述的重组菌株，其特征在于，所述强化包括过通过过表达的方式上调所述的参与过氧化氢分解相关基因的表达。

4.如权利要求2所述的重组菌株，其特征在于，所述trx1基因，核苷酸序列如seq idno：1所示；

5.如权利要求2所述的重组菌株，其特征在于，所述粟酒裂殖酵母宿主为粟酒裂殖酵母sp.65，保藏编号cgmcc no.21792。

6.如权利要求2所述的重组菌株，其特征在于，以粟酒裂殖酵母sp.65为出发菌株，通过整合过表达提高trx1、tpx1或pmp20的表达量，获得一株高耐受乙酸、乳酸的重组菌株。

7.权利要求2-6任意一项所述重组菌株的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，是在生物燃料乙醇、或白酒等酒精饮料生产中的应用。

技术总结
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种提高粟酒裂殖酵母对乙酸、乳酸或其他有机酸耐受性的方法。本发明通过强化粟酒裂殖酵母中参与过氧化氢分解相关基因的表达，从而提高粟酒裂殖酵母对乙酸、乳酸等有机酸的耐受能力。所述参与过氧化氢分解相关基因包括但不限于trx1、tpx1和pmp20。本发明构建的粟酒裂殖酵母重组菌株::trx1、::tpx1、::pmp20，在8g/L乙酸和35g/L乳酸双重酸胁迫条件下，经148h发酵后，相比野生型菌株，乙醇产量分别提升11％、18％和35％，增加了菌株在酸胁迫下的乙醇产生效率。

技术研发人员：张翠英,林良才,戎梓溢,李超,肖冬光
受保护的技术使用者：天津科技大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13