一种产两性霉素B的形态优化重组结节链霉菌及其应用

本发明属于基因工程与发酵工程领域，具体设计一种产两性霉素b的基因工程菌及构建方法，以及一种通过结节链霉菌细胞形态优化和外源改变发酵环境提高两性霉素b生产效率的生产方法。

背景技术：

1、两性霉素b(amphotericin b，amb)是一种多烯大环内酯类抗真菌抗生素，由结节链霉菌(streptomyces nodosus)产生，其菌株于1955年从委内瑞拉奥里诺科河三角洲的土样中收集分离获的，同时发现其具有抗真菌的活性。1959年，在结节链霉菌发酵液中提取获的amb。1966年开始上市，是第一个用于深部真菌感染的治疗药物。半个世纪以来，amb仍是临床上不可替代的抗真菌药物。

2、在两性霉素b提产方面，主要集中于过表达代谢关键基因。2016年sweeney等通过表达amb生物合成基因簇调控基因amphriv，相比原始菌株其两性霉素a和两性霉素b的总产量提高了3倍，张等人分析了摇瓶内添加玻璃珠对两性霉素b产量的影响，研究结果表明，添加玻璃珠后能显著改善菌丝聚集情况并显著提高amb的产量，产量与对照组相比提高了341.1％，达到4563.2mg/l。同年，段宝玲等通过优化有机复合氮源和发酵条件以降低批次间氮源对发酵代谢的影响，同时进一步添加前体物质，促进两性霉素b生物合成，最终发酵单位达到14469μg/ml，较优化前提高103％，发酵时间缩短14％。2020年huang等在s.nodosus zjb2016050中过表达乙酰辅酶a羧化酶、甲基丙二酰变位酶、甲基丙二酰异构酶基因，增加合成amb前体供应，amb产量最终在5l发酵罐中达到15.60g/l。同年，zhang等开发了一种联合补料策略，通过添加关键前体及差异代谢物，进行分阶段发酵调控，使得amb产量达到18.39g/l，这也是迄今为止报道的最高amb产量。

3、链霉菌属的成员以其复杂的形态而闻名，其多细胞生长始于单个孢子的萌发，通过线形顶端延伸和菌丝分枝生长成营养菌丝体，然后形成气生菌丝体，最后分化成单核细胞，进一步发育成孢子。故其生长特征是菌丝网络和菌球的形成。这就导致从工业发酵的角度来看，它生长缓慢、高粘度，并具有培养异质性，严重限制了其工业化生产。

技术实现思路

1、本发明目的是提供低粘稠度且高产两性霉素b的重组结节链霉菌、构建方法及其应用，通过过表达结节链霉菌细胞形态相关基因ssga，获得菌丝形态突变的工程菌株，同时外源改变发酵环境，缓解发酵过程中高粘稠度，耗能高的问题，有效提升amb的生产效率。

2、为实现本发明的上述目的，本发明采用的技术方案如下：

3、一种产两性霉素b的重组结节链霉菌，所述重组结节链霉菌包含外源红霉素强启动子ermep*与外源adpa调节子基因ssga。

4、所述外源红霉素强启动子ermep*核苷酸序列如seq id no.1所示，所述外源adpa调节子基因ssga核苷酸序列如seq id no.2所示。

5、具体的，所述的重组结节链霉菌，由如下方法构建获得：

6、(1)将pcr克隆获得的红霉素强启动子ermep*插入pjtu1278载体质粒多克隆位点处，得到重组载体pjtu1278-ermep*；

7、(2)将adpa调节子基因ssga插入步骤1所构建的质粒中，得到重组质粒pjtu1278-ssga*，导入供体菌大肠杆菌；

8、(3)通过接合转移方法将步骤(2)构建的含有重组质粒的供体菌株大肠杆菌导入受体菌结节链霉菌zjb2016050中(保藏编号：cctcc no：m2017426)，得到基因工程菌zjb2016050-ssga*，即所述产两性霉素b的重组结节链霉菌。

9、本发明还提供一种重组表达质粒，所述重组表达质粒包含红霉素强启动子ermep*与adpa调节子基因ssga；所述红霉素强启动子ermep*核苷酸序列为seq id no.1所示，所述adpa调节子基因ssga核苷酸序列为seq id no.2所示。

10、所述重组表达质粒是将所述红霉素强启动子ermep*与adpa调节子基因ssga导入pjtu1278载体得到的。

11、本发明还提供一种基于结节链霉菌细胞形态的两性霉素生产方法。

12、具体的，所述方法包括：将结节链霉菌接种至发酵培养基，添加惰性颗粒，26～30℃、400～500r/min条件下培养96～168h，发酵结束后，发酵产物经分离纯化获得所述的两性霉素b。所述的惰性颗粒为下列之一：滑石粉，氧化铁，氧化铝或玻璃研磨珠。玻璃研磨珠的粒径优选0.2～0.4mm。

13、通常，所述发酵培养基组成包括如下组分：葡萄糖60～80g/l，牛肉膏5～10g/l，大豆蛋白粉5～10g/l，棉子粉8～30g/l，碳酸钙5～10g/l，kh2po40.1～0.4g/l，无水氯化钙0.05～1g/l，溶剂为水，ph为7.0～7.2。

14、进一步，优选所述惰性颗粒滑石粉的添加浓度为2.5～20g/l,氧化铁的添加浓度为5～15g/l,氧化铝的添加浓度为10～20g/l,0.2～0.4mm玻璃研磨珠的添加浓度5～10g/l。

15、本发明有益效果主要体现在：(1)本发明获得的突变菌株具有更为单一粗壮菌丝，抑制链霉菌发酵过程中凝结成团，便于工业化生产中降低发酵液粘稠度，同时amb产量进一步提高；(2)调整发酵转速，外源添加惰性颗粒改善链霉菌菌丝凝结成团的情况，进一步提高了amb产量。

技术特征：

1.一种产两性霉素b的形态优化重组结节链霉菌，其特征在于：所述重组结节链霉菌包含外源红霉素强启动子ermep*与外源adpa调节子基因ssga。

2.如利要求1所述的重组结节链霉菌，其特征在于：所述外源红霉素强启动子ermep*核苷酸序列如seq id no.1所示，所述外源adpa调节子基因ssga核苷酸序列如seq id no.2所示。

3.如权利要求1所述的重组结节链霉菌，其特征在于：重组结节链霉菌由如下方法构建获得：

4.一种重组表达质粒，其特征在于：所述重组表达质粒包含红霉素强启动子ermep*与adpa调节子基因ssga；所述红霉素强启动子ermep*核苷酸序列为seq id no.1所示，所述adpa调节子基因ssga核苷酸序列为seq id no.2所示。

5.如权利要求4所述的重组表达质粒，其特征在于：所述重组表达质粒是将所述红霉素强启动子ermep*与adpa调节子基因ssga导入pjtu1278载体得到的。

6.一种两性霉素b的提产方法，其特征在于：所述方法为：将权利要求1～3之一所述的重组结节链霉菌接种至发酵培养基，添加惰性颗粒，26～31℃、400～500r/min条件下培养96～168h，发酵结束后，发酵产物经分离纯化获得所述的两性霉素b。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述的惰性颗粒为下列之一：滑石粉，氧化铁，氧化铝或玻璃研磨珠。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述滑石粉的添加浓度为2.5～25g/l，氧化铁的添加浓度为2.5～20g/l，氧化铝的添加浓度为2.5～25g/l,玻璃研磨珠的添加浓度为2.5～20g/l。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基组成包括以下组分：葡萄糖60～80g/l，牛肉膏5～10g/l，大豆蛋白粉5～10g/l，棉籽粉8～30g/l，碳酸钙5～10g/l，kh2po40.1～0.4g/l，无水氯化钙为0.05～1g/l，溶剂为水，ph为7.0～7.2。

10.如权利要求6所述的方法，其特征在于：前48h发酵温度控制为31℃，在48h后将温度控制为26℃。

技术总结
本发明涉及了一种基于结节链霉菌细胞形态的菌种改造及应用，通过过表达AdpA调节子基因(SsgA基因)改变结节链霉菌细胞形态以及通过添加惰性颗粒，改变转速，发酵温度的方法改善结节链霉菌发酵环境，从而达到提升两性霉素B产量，降低发酵液粘度，最终实现生产过程节能、降耗的目的。本发明从结节链霉菌细胞形态层面出发，针对结节链霉菌发酵过程中菌丝缠绕粘稠的问题，提供一个最佳的菌体生长和产物合成的外部环境，同时对细胞形态相关基因进行改造，降低发酵液粘稠度，降低发酵耗能，提升两性霉素B产量。采用本发明发酵方法，两性霉素B放罐单位可以达到14g/L以上。发酵液粘稠度降低19.7％。为工业菌株改造提供新思路。

技术研发人员：柳志强,谢丁缙,张博,吴哲明,郑裕国
受保护的技术使用者：浙江工业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13