改良中性甘露聚糖酶PLM5A的稳定性的方法及突变体

本发明涉及农业生物，具体涉及改良中性甘露聚糖酶plm5a的稳定性的方法及突变体。

背景技术：

1、甘露聚糖酶是一种能降解甘露聚糖、葡萄甘露聚糖和半乳甘露聚糖主链的水解酶，属于半甘露聚糖酶类，在食品、医药、造纸、饲料和石油等工业中具有重要的应用。

2、近年来，甘露聚糖酶在饲料行业的应用受到越来越多的关注。饲料中含有的非淀粉多糖如β-甘露聚糖是家禽的抗营养因子，不易被消化，增加家禽的肠道粘度。β-甘露聚糖酶可以分解β-甘露聚糖产生甘露寡糖，减少β-甘露聚糖与水分子的结合，促进家禽肠道蠕动，防止食物堆积。甘露寡糖可以与大肠杆菌等有害菌表面外源凝集素结合，抑制有害菌与肠道上的受体接触，有效阻止病原菌的繁殖，同时作为营养物质促进有益菌如双歧杆菌和乳酸菌大量增殖，保持肠道环境的酸碱平衡。研究表明，在家禽饲料中添加β-甘露聚糖酶可以提高家禽体重和饲料利用率，并能够改善家禽肠道环境，提高家禽免疫力。

3、为了满足饲料工业需要，理想的β-甘露聚糖酶应具有比活性高、热稳定性好、耐酸性强等特点。大多数天然β-甘露聚糖酶不具备这些性质。

4、研究者一直致力于对β-甘露聚糖酶进行分子改造，以增强其稳定性和活性。然而，目前市售的甘露聚糖酶仍普遍存在催化效率不高、热稳定性差、酶活损失快等缺点，因此研究开发热稳定性高、耐酸性强的甘露聚糖酶，对于提升甘露聚糖酶的综合性能，降低甘露聚糖酶的使用成本具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供改良中性甘露聚糖酶plm5a的稳定性的方法。

2、本发明的另一目的是提供稳定性改良的中性甘露聚糖酶plm5a。

3、根据本发明的改良中性甘露聚糖酶plm5a的稳定性的方法，所述方法包括对所述中性甘露聚糖酶plm5a的氨基酸序列进行k52v突变的步骤，其中，所述中性甘露聚糖酶plm5a的ncbi序列编号为wp_125083321.1(seq id no:1)。

4、seq id no:1

5、mknlrkkslsicmamammfslvtllggqdiraasgfyvsgtilcdstgnpfkirginhahswf

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10、根据本发明的改良中性甘露聚糖酶plm5a的稳定性的方法，所述方法包括对所述中性甘露聚糖酶plm5a的氨基酸序列进一步进行t266d突变的步骤。

11、根据本发明的改良中性甘露聚糖酶plm5a的稳定性的方法，所述方法包括对所述中性甘露聚糖酶plm5a的氨基酸序列进一步进行w291s突变的步骤。

12、根据本发明的改良中性甘露聚糖酶plm5a的稳定性的方法，所述方法包括对所述中性甘露聚糖酶plm5a的氨基酸序列进一步进行a93l和/或k205r突变的步骤。

13、根据本发明的改良中性甘露聚糖酶plm5a的稳定性的方法，所述方法包括对所述中性甘露聚糖酶plm5a的氨基酸序列进一步进行f63y、d66y、s283l、g288s和l292i突变的步骤。

14、根据本发明的稳定性改良的中性甘露聚糖酶突变体，所述突变体的序列为中性甘露聚糖酶plm5a的氨基酸序列进行k52v突变后的序列，其中，所述中性甘露聚糖酶plm5a的ncbi序列编号为wp_125083321.1。

15、根据本发明的稳定性改良的中性甘露聚糖酶突变体，所述突变体的序列为中性甘露聚糖酶plm5a的氨基酸序列进一步进行t266d后的序列。

16、根据本发明的稳定性改良的中性甘露聚糖酶突变体，所述突变体的序列为中性甘露聚糖酶plm5a的氨基酸序列进一步进行w291s后的序列。

17、根据本发明的稳定性改良的中性甘露聚糖酶突变体，所述突变体的序列为中性甘露聚糖酶plm5a的氨基酸序列进一步进行a93l和/或k205r后的序列。

18、根据本发明的稳定性改良的中性甘露聚糖酶突变体，所述突变体的序列为中性甘露聚糖酶plm5a的氨基酸序列进一步进行f63y、d66y、s283l、g288s和l292i突变的序列。

19、在80℃处理5min，实验结果显示，其中17个单点突变体蛋白的热稳定性较野生型plm5a蛋白具有明显的改善，而另外13个单点突变体的热稳定性较野生型蛋白并无改善甚至变差。

20、三个多点突变体蛋白plm5amut1、plm5amut2、plm5amut3的热稳定性较野生型plm5a蛋白具有明显的提升，其中突变体plm5amut3的热稳定性最好。

21、plm5a的最适温度为60℃，而plm5amut3最适温度提高至75℃。将plm5a和plm5amut3在80℃处理5min后，plm5a的残余酶活力仅剩15％左右，80℃处理10min后plm5a已完全失活。而plm5amut3经80℃处理5min后，剩余酶活力仍在95％以上，在80℃处理60min后，剩余酶活力仍高于50％，表现出优异的热稳定性。

22、发现plm5amut3与plm5a的最适ph值相似。而plm5amut3相较于plm5a野生型蛋白具有更强的耐酸性。在ph 2.0的缓冲液中处理1h后，plm5a野生型蛋白的酶活力已完全丧失，在ph 3.0的缓冲液中处理1h后，plm5a野生型蛋白仅剩余30％左右酶活力；而plm5amut3在ph 2.0的缓冲液中处理1h后，仍保留30％以上的酶活力。在ph 3.0的缓冲液中处理1h后，仍保留50％以上的酶活力。

技术特征：

1.一种改良中性甘露聚糖酶plm5a的稳定性的方法，其特征在于，所述方法包括对所述中性甘露聚糖酶plm5a的氨基酸序列进行k52v突变的步骤，其中，所述中性甘露聚糖酶plm5a的ncbi序列编号为wp_125083321.1。

2.根据权利要求1所述的改良中性甘露聚糖酶plm5a的稳定性的方法，其特征在于，所述方法进一步包括对所述中性甘露聚糖酶plm5a的氨基酸序列进行t266d突变的步骤。

3.根据权利要求2所述的改良中性甘露聚糖酶plm5a的稳定性的方法，其特征在于，所述方法进一步包括对所述中性甘露聚糖酶plm5a的氨基酸序列进行w291s突变的步骤。

4.根据权利要求1所述的改良中性甘露聚糖酶plm5a的稳定性的方法，其特征在于，所述方法进一步包括对所述中性甘露聚糖酶plm5a的氨基酸序列进行a93l和/或k205r突变的步骤。

5.根据权利要求4所述的改良中性甘露聚糖酶plm5a的稳定性的方法，其特征在于，所述方法进一步包括对所述中性甘露聚糖酶plm5a的氨基酸序列进行f63y、d66y、s283l、g288s和l292i突变的步骤。

6.一种稳定性改良的中性甘露聚糖酶突变体，其特征在于，所述突变体的序列为中性甘露聚糖酶plm5a的氨基酸序列进行k52v突变后的序列，其中，所述中性甘露聚糖酶plm5a的ncbi序列编号为wp_125083321.1。

7.根据权利要求6所述的稳定性改良的中性甘露聚糖酶突变体，其特征在于，所述突变体的序列为中性甘露聚糖酶plm5a的氨基酸序列进一步进行t266d后的序列。

8.根据权利要求7所述的稳定性改良的中性甘露聚糖酶突变体，其特征在于，所述突变体的序列为中性甘露聚糖酶plm5a的氨基酸序列进一步进行w291s后的序列。

9.根据权利要求8所述的稳定性改良的中性甘露聚糖酶突变体，其特征在于，所述突变体的序列为中性甘露聚糖酶plm5a的氨基酸序列进一步进行a93l和/或k205r后的序列。

10.根据权利要求9所述的稳定性改良的中性甘露聚糖酶突变体，其特征在于，所述突变体的序列为中性甘露聚糖酶plm5a的氨基酸序列进一步进行f63y、d66y、s283l、g288s和l292i突变的序列。

技术总结
本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及改良中性甘露聚糖酶PLM5A稳定性的方法及突变体。本申请对中性甘露聚糖酶PLM5A进行K52V、T266D、W291S、A93LK205R、F63Y、D66Y、S283L、G288S和/或L292I突变。突变体的最适温度提高，热稳定性增加，具有更强的耐酸性。

技术研发人员：黄火清,徐欣欣,罗会颖,王苑,张红莲,杨浩萌,柏映国,涂涛,苏小运,姚斌,于会民
受保护的技术使用者：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13