一种基于荧光保留探针评估细胞DNA单链断裂修复能力的方法

本发明属于细胞生存及修复力检测，具体涉及一种基于荧光保留探针评估细胞dna单链断裂修复能力的方法。

背景技术：

1、目前，检测细胞dna链断裂修复能力的方法主要有放射法、液体计数法、超速离心法、病毒复活法以及染色互换法。

2、其中，放射法、液体计数法和超速离心法都需用放射性物质，安全风险大，且放射性物质标记核苷酸也是一重要技术环节，与此同时，超速离心法所需设备属贵重仪器。病毒复活法是通过检测受损伤病毒的生存繁殖间接反映细胞的dna修复能力，需要与细胞适配的特种病毒并对其培养；存在精确度低，所需时间较长和操作繁琐的缺点。染色体互换法全称姐妹染色单体互换法，某些dna修复功能的缺陷导致染色体稳定性减弱诱发姐妹染色单体互换率的提高，仅能反映一部分dna修复能力。基于此，急需研发一种新型评估细胞dna单链断裂修复能力的方法，以有效解决上述问题。

技术实现思路

1、本发明的目的就在于提供一种基于荧光保留探针评估细胞dna单链断裂修复能力的方法，以解决通过荧光强度评估细胞自身的dna断链修复能力的问题，该方法使用安全、检测时间短、范围广且精确度高。

2、本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

3、一种荧光保留探针评估细胞dna单链断裂修复能力的方法，包括以下步骤：

4、a、取一定数量的细胞，破坏细胞膜，释放出细胞核混合组分，该组分含有一定数量的与dna链断裂修复能力相关的酶等物质；

5、b、向上述混合物中加入两种芘单体标记的寡核苷酸链、多聚核苷酸激酶、dna连接酶、bst dna聚合酶和dntp；所述两种寡核苷酸链的起始末端设有互补的碱基序列段；

6、c、退火复性及bst dna聚合酶催化的核苷酸链延伸：在退火反应及bst dna聚合酶催化的核苷酸链延伸后，用荧光分光光度计测定发射波峰及强度即可评估细胞dna单链断裂修复能力的强弱。

7、进一步地，步骤b，其中，所述两种芘单体标记的寡核苷酸链是在寡核苷酸链a3′端和寡核苷酸链b5′端分别标记芘单体，且寡核苷酸链a和b互补形成发夹形结构。

8、更进一步地，所述两种芘单体标记的寡核苷酸链以344nm为激发波长，在378nm和397nm具有最大发射波峰，发出蓝色荧光。

9、进一步地，步骤c具体为：细胞具有dna单链断裂修复能力，在多聚核苷酸激酶、dna连接酶及dntp等存在条件下，将两种寡核苷酸链断开的磷酸二酯键修复，bst dna聚合酶则不能消化寡核苷酸链a，维持芘激动剂修饰的发夹形结构，在488nm具有最大发射波峰，发出绿色荧光，在寡核苷酸链浓度、反应体系一定的前提下，绿色荧光强度与细胞dna单链断裂修复能力成正相关。

10、进一步地，步骤c具体为：细胞dna单链断裂修复能力差或不具有时，在多聚核苷酸激酶、dna连接酶及dntp等存在条件下，bst dna聚合酶将消化原来芘修饰的互补寡核苷酸链a，以dntp为原料沿b链3'端延长形成不带修饰的新核苷酸链，此反应产物虽然仍具有发夹结构，但仅有1个芘单体，在378nm和397nm具有最大发射波峰，发出蓝色荧光；在寡核苷酸链浓度、反应体系一定的前提下，可通过荧光度强度或比值，评估细胞dna单链断裂修复能力的强弱。

11、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

12、本发明采用荧光保留探针评估细胞dna单链断裂修复能力，荧光标记的寡核苷酸链具有更高的生物安全性，适用于多种细胞类型，荧光强度与细胞自身的dna断链修复能力直接相关，既可肉眼观测粗略评估，也可采用荧光分光光度计精确定量检测，比较不同细胞dna链断裂修复能力的强弱；具有使用安全、检测时间短、范围广及精确度高的优势。

技术特征：

1.一种荧光保留探针评估细胞dna单链断裂修复能力的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种荧光保留探针评估细胞dna单链断裂修复能力的方法，其特征在于：步骤b，其中，所述两种芘单体标记的寡核苷酸链是在寡核苷酸链a3′端和寡核苷酸链b5′端分别标记芘单体，且寡核苷酸链a和b互补形成发夹形结构。

3.根据权利要求2所述的一种荧光保留探针评估细胞dna单链断裂修复能力的方法，其特征在于：所述两种芘单体标记的寡核苷酸链以344nm为激发波长，在378nm和397nm具有最大发射波峰，发出蓝色荧光。

4.根据权利要求1所述的一种荧光保留探针评估细胞dna单链断裂修复能力的方法，其特征在于：步骤c具体为：细胞具有dna单链断裂修复能力，在多聚核苷酸激酶、dna连接酶及dntp等存在条件下，将两种寡核苷酸链断开的磷酸二酯键修复，bst dna聚合酶则不能消化寡核苷酸链a，维持芘激动剂修饰的发夹形结构，在488nm具有最大发射波峰，发出绿色荧光，在寡核苷酸链浓度、反应体系一定的前提下，绿色荧光强度与细胞dna单链断裂修复能力成正相关。

5.根据权利要求1所述的一种荧光保留探针评估细胞dna单链断裂修复能力的方法，其特征在于：步骤c具体为：细胞dna单链断裂修复能力差或不具有时，在多聚核苷酸激酶、dna连接酶及dntp等存在条件下，bst dna聚合酶将消化原来芘修饰的互补寡核苷酸链a，以dntp为原料沿b链3'端延长形成不带修饰的新核苷酸链，此反应产物虽然仍具有发夹结构，但仅有1个芘单体，在378nm和397nm具有最大发射波峰，发出蓝色荧光；在寡核苷酸链浓度、反应体系一定的前提下，可通过荧光度强度或比值，评估细胞dna单链断裂修复能力的强弱。

技术总结
本发明涉及一种基于荧光保留探针评估细胞DNA单链断裂修复能力的方法，包括破坏细胞膜释放出细胞核混合组分；加入两种芘单体标记的寡核苷酸链、多聚核苷酸激酶、DNA连接酶、Bst DNA聚合酶和dNTP；在退火反应及Bst DNA聚合酶催化的核苷酸链延伸后，用荧光分光光度计测定发射波峰及强度即可评估细胞DNA单链断裂修复能力的强弱。本方法荧光标记的寡核苷酸链具有更高的生物安全性，适用于多种细胞类型，荧光强度与细胞自身的DNA断链修复能力直接相关，既可肉眼观测粗略评估，也可采用荧光分光光度计精确定量检测，比较不同细胞DNA链断裂修复能力的强弱；具有使用安全、检测时间短、范围广及精确度高的优势。

技术研发人员：房恒通,焦虎平,张晶,周博,李印
受保护的技术使用者：吉林大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13