一种新型DC样细胞的制备方法及应用与流程

本发明涉及细胞免疫，更具体的说是一种新型dc样细胞的制备方法及应用。

背景技术：

1、dc治疗疫苗是目前国内外免疫治疗领域的研究热点，这一技术往往通过采集受者外周血，分离贴壁的单个核细胞，与细胞因子和抗原进行联合培养，从而获得抗原靶向的dc细胞，再将这一诱导后的dc回输人体，激活效应t淋巴细胞，从而达到控制病患的目的。由于t细胞活化后，可形成抗原记忆性t细胞存留于体内，较长时间保持机体的免疫攻击能力，所以这一技术也可以称为dc疫苗。

2、dc疫苗比其他的免疫治疗技术更符合机体天然免疫反应过程，患者耐受性良好、很少引发细胞因子风暴等失控的免疫反应，而且可以成为其他免疫治疗（如pd-1阻断剂）的应用前题。目前的dc疫苗技术最突出的问题是dc细胞数量与功能不足：外周血单个核细胞数量有限（约占外周血白细胞1%），且不能有效增殖，而每次治疗能够采集到的受者的血液量不会超过200ml（约占人体总量的5%），这就造成了可以诱导成功的dc数量较少，临床应用效果受限。国内外大多数dc疫苗方案还处于临床研究阶段。

3、因此提供一种不受采血限制的新型dc样细胞的制备方法及应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种新型dc样细胞的制备方法及应用。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种新型dc样细胞的制备方法，具体包括以下步骤：

4、（1）获取悬浮细胞：

5、采集外周血，用pbs稀释，缓慢加至淋巴细胞分离液液面上方，保持分层状态并离心；抽取淋巴液和血清之间的细胞层，加入pbs洗涤并离心，收集细胞沉淀；制备悬浮细胞液，过夜培养，洗涤定容备用；

6、（2）分选cd19+细胞：

7、将抗体加入至步骤（1）制备的悬浮细胞液混匀，静置孵育；加入磁珠混匀，静置孵育；加入缓冲液混匀，在磁极中孵育；通过正负分选得到正选：cd19+细胞，洗涤定容备用；

8、（3）dc样细胞的诱导及抗原负载：

9、将dc样细胞诱导剂加入至步骤（2）获得的cd19+细胞，连续培养，得dc样细胞；将负载抗原与培养添加剂加入至dc样细胞，继续培养，得抗原负载的dc样细胞。

10、进一步的，步骤（1）中所述pbs稀释倍数为1倍；所述保持分层状态并离心的转速为1500rpm，离心30分钟；

11、所述加入pbs洗涤并离心的转速为2000rpm，离心20分钟，该步骤共重复三次；

12、所述制备悬浮细胞液：用含10%胎牛血清的dmem高糖培养基悬浮所述细胞沉淀，定容至2×106个细胞/ml；所述洗涤定容备用：将所述悬浮细胞液于2000rpm离心20分钟，弃上清，加入含10%胎牛血清的dmem高糖培养基悬浮细胞，定容至5×106个细胞/ml。

13、进一步的，步骤（2）中所述抗体为100 μl/ml；所述孵育时间均为3min；所述加入磁珠前涡旋震动磁珠作用30s，使磁珠颗粒均匀分散；所述缓冲液为含edta的pbs buffer液，补充至2.5ml；所述洗涤定容：离心，在正选管中吸取分选buffer液，反复吹打管壁细胞，3-4ml液体量 2000rpm，离心10min 弃上清，分选出cd19+细胞，定容至2×106个细胞/ml。

14、进一步的，步骤（3）中所述dc样细胞诱导剂包括rhil-4、rhgm-csf，所述rhil-4、rhgm-csf的用量为10ng/ml。

15、进一步的，步骤（3）中所述dc样细胞诱导剂包括添加剂，所述添加剂为油酸，用量为10ng/ml。

16、进一步的，步骤（3）中所述连续培养为培养4天，每隔日半量换液；所述继续培养为培养72小时。

17、进一步的，一种新型dc样细胞在制备治疗癌症的药物中的应用。

18、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明有益效果如下：

19、1）本申请制备的dc样细胞由外周血半悬浮细胞诱导而来，而dc细胞是外周血贴壁的单个核细胞诱导而来。本申请制备的dc样细胞不受外周血贴壁单个核细胞的数量限制；

20、2）理论上dc样细胞具有一定增殖能力，一旦抗原靶向活化后，可以通过分裂增殖，来弥补dc数量不足的问题；

21、3）dc样细胞本身具有记忆性，突破了原有的dc细胞不具有记忆性的特点；

22、4）dc样细胞具有dc细胞类似的安全性，在提高dc疫苗的同时，依旧保持了dc疫苗技术患者的可耐受性，动物实验显示，应用到小鼠体重的0.5‰，依然耐受良好；

23、5）肿瘤治疗的临床应用：肿瘤患者自体cd19+细胞已经接触过肿瘤细胞，但在发病的肿瘤微环境及患者身体内，其功能往往被抑制，如采用体外激活和负载特定肿瘤抗原，可有效进一步活化并形成肿瘤靶向记忆，回输体内后可持续稳定对肿瘤抗原呈递，这一对肿瘤的记忆，尤其在抗原呈递过程中的记忆，有机会治疗复发和转移的肿瘤。本申请动物实验表明dc样细胞治疗的小鼠肿瘤结节显著少于未治疗组，为本申请进一步在治疗肿瘤的临床应用方向打下坚实基础。

技术特征：

1.一种新型dc样细胞的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种新型dc样细胞的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述pbs稀释倍数为1倍；所述保持分层状态并离心的转速为1500rpm，离心30分钟；

3.根据权利要求1所述的一种新型dc样细胞的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述抗体与悬浮细胞液的体积比为1:10，所述抗体为抗cd19单抗，所述抗体浓度为1μg/ml；所述孵育时间均为3min；

4.根据权利要求1所述的一种新型dc样细胞的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述dc样细胞诱导剂包括rhil-4、rhgm-csf，所述rhil-4、rhgm-csf的用量为10ng/ml。

5.根据权利要求4所述的一种新型dc样细胞的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述dc样细胞诱导剂包括添加剂，所述添加剂为油酸，用量为10ng/ml。

6.根据权利要求1所述的一种新型dc样细胞的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述连续培养为培养4天，每隔日半量换液；所述继续培养为培养72小时。

7.权利要求1所述一种新型dc样细胞在制备治疗癌症的药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种新型DC样细胞的制备方法及应用，涉及细胞免疫技术领域。具体包括以下步骤：（1）获取悬浮细胞；（2）分选CD19+细胞；（3）DC样细胞的诱导及抗原负载。肿瘤患者自体CD19+细胞已经接触过肿瘤细胞，但在发病的肿瘤微环境及患者身体内，其功能往往被抑制，如采用体外激活和负载特定肿瘤抗原，可有效进一步活化并形成肿瘤靶向记忆，回输体内后可持续稳定对肿瘤抗原呈递，这一对肿瘤的记忆，尤其在抗原呈递过程中的记忆，有机会治疗复发和转移的肿瘤。

技术研发人员：徐世文,邓为民,郁春燕,于建春,李阳
受保护的技术使用者：天津纽赛生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12