一种脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备方法及应用

本发明属于生物类提取药领域，具体涉及一种脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备方法及应用。

背景技术：

1、外泌体(exosomes)是指包含了复杂rna和蛋白质的小膜泡(30-150nm)，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。现有的外泌体提取方法中，差速离心法是最常用的外泌体提取手段，采用不同的离心条件逐次离心，可完成外泌体的提取分离。差速离心虽然操作简单，但过程费时，且需要反复分离和杂质的分离操作，不仅不利于大规模提取，而且回收率不稳定，严重影响了后续外泌体活性的研究，也阻碍了外泌体的临床应用。

技术实现思路

1、基于上述问题，本发明提供了一种脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备方法及应用，运用native-page凝胶技术结合电泳方法，实现了一体式、大规模分离外泌体，并且能够明显提高其生物活性，极大了方便了外泌体相关研究的进行。

2、本发明的技术方案是这样实现的：

3、一种脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备方法，包括以下步骤：

4、(1)在绝缘的容器内设置液体管，液体管由0.45μm的滤膜构成，且底部封闭；液体管外侧依次包裹0.1μm膜和超滤膜，在0.45μm膜和0.1μm膜、0.1μm膜和超滤膜以及超滤膜和容器之间加入native-page凝胶；

5、(2)脐静脉间充质干细胞培养后，分离出上清液，加入液体管中；液体管的液体上下两端分别连接正、负电极，通入电流，电压120v，电流20ma，时间4-8h，外泌体即可通过超滤膜，留在超滤膜和容器之间，实现与其他物质的分离。

6、进一步，所述步骤(2)中，电极设置时，正极位于液体管内液体的上方，负极在液体管内液体的下方；所述的电极为bio-rad电泳电极。

7、进一步，所述步骤(2)中，电极两端分别连接铂金丝，铂金丝没入液体管的液体中。

8、一种脐带间充质干细胞来源的外泌体，采用上述制备方法制备而成。

9、上述制备方法制备的外泌体在制备对血管内皮细胞损伤具有保护作用的制剂上的应用。

10、进一步，所述的血管内皮细胞损伤为血管内皮细胞迁移能力损伤、和/或血管内皮细胞存活率降低、和/或血管内皮细胞中炎症和能量稳态调控因子失调。

11、进一步，所述的血管内皮细胞炎症和能量稳态调控因子失调包括：核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nlrp3)水平提升、和/或磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-ampk)水平降低、和/或gasdermin-d(gsdmd)水平提升。

12、进一步，所述的血管内皮细胞损伤为氧糖剥夺模型所致的血管内皮细胞损伤。

13、上述制备方法制备的外泌体在制备对脑缺血损伤具有保护作用的制剂上的应用。

14、进一步，所述的脑缺血损伤为大脑中动脉栓塞(mcao)导致的脑梗死。

15、有益效果：

16、本发明所述的脐带间充质干细胞来源的外泌体制备方法，运用native-page凝胶技术，结合常规的电泳技术，不需要复杂的离心和杂质分离操作，实现了一体式分离外泌体的操作，外泌体的提取率可以提高一倍左右。由于操作简单，提取率高，可以大规模提取分离获得外泌体，不局限于微量的外泌体分离操作，为后续相关实验的开展提供了充足的原料，为外泌体相关活性的研究奠定了基础。

17、此外，采用本发明所述的分离方法分离获得的外泌体，纯化效果好，不影响生物活性。经实验验证，采用本发明所述的方法分离获得的外泌体，对于氧糖剥夺模型所致的大鼠血管内皮细胞损伤具有显著的保护作用，对大鼠mcao模型的所致的脑缺血损伤也具有显著的保护作用。

技术特征：

1.一种脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，电极设置时，正极位于液体管内液体的上方，负极在液体管内液体的下方；所述的电极为bio-rad电泳电极。

3.如权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，电极两端分别连接铂金丝，铂金丝没入液体管的液体中。

4.一种脐带间充质干细胞来源的外泌体，其特征在于，采用权利要求1-3任一项所述的制备方法制备而成。

5.如权利要求1-3任一项所述的制备方法制备的外泌体、或如权利要求4所述的外泌体在制备对血管内皮细胞损伤具有保护作用的制剂上的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的血管内皮细胞损伤为血管内皮细胞迁移能力损伤、和/或血管内皮细胞存活率降低、和/或血管内皮细胞中炎症和能量稳态调控因子。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的血管内皮细胞炎症和能量稳态调控因子失调包括：核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nlrp3)水平提升、和/或磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-ampk)水平降低、和/或gasdermin-d(gsdmd)水平提升。

8.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的血管内皮细胞损伤为氧糖剥夺模型所致的血管内皮细胞损伤。

9.如权利要求1-3任一项所述的制备方法制备的外泌体、或如权利要求4所述的外泌体在制备对脑缺血损伤具有保护作用的制剂上的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的脑缺血损伤为大脑中动脉栓塞(mcao)导致的脑梗死。

技术总结
本发明属于生物类提取药领域，具体涉及一种脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备方法及应用。本发明所述的脐带间充质干细胞来源的外泌体制备方法，运用Native‑Page凝胶技术，结合常规的电泳技术，实现了一体式分离外泌体的操作，外泌体的提取率可以提高一倍左右，并且可以大规模提取分离获得外泌体，不局限于微量的外泌体分离操作。经实验验证，采用本发明所述的方法分离获得的外泌体，对于氧糖剥夺模型所致的大鼠血管内皮细胞损伤具有显著的保护作用，同时对大鼠MCAO模型所致的脑缺血损伤也具有显著的保护作用。

技术研发人员：刘启兵,吴昊霖,方星悦,吴昕泽,符兆理,徐怡倩,郭青云,易西南
受保护的技术使用者：海南医学院第一附属医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13