硫氧还蛋白介导重组蛋白在大肠杆菌胞外分泌表达的方法

本发明属于生物工程，特别涉及硫氧还蛋白介导重组蛋白在大肠杆菌胞外表达的方法。

背景技术：

1、大肠杆菌因其遗传图谱明确，培养费用低等优点而被广泛应用于外源蛋白的表达。在大肠杆菌系统中，根据重组蛋白表达后的空间定位，可分为胞内表达与胞外表达。胞外表达通常形成可溶性产物。胞内表达又可分为胞质中表达与周质空间表达，其所表达的外源蛋白经常会形成包涵体。胞外表达与周质空间表达的蛋白较少受到蛋白酶的降解，有利于目标产物的积累。大肠杆菌有多种转运系统将蛋白分泌至周质空间，最常用的是sec系统。但大肠杆菌缺乏天然的胞外分泌机制，大多数的重组蛋白只能通过内膜分泌到大肠杆菌的周质中，难以主动分泌到培养基中。胞内重组蛋白的常规生产工艺包括菌株选择、表达载体构建、表达后的破碎细胞、重组蛋白分离与纯化。但因胞内杂蛋白成分复杂、易形成无活性的包涵体，因而分离成本高、产率低。尤其是胞内表达需要破碎细胞，规模化生产过程中需要特殊的设备，得到提高了生产成本。因此，一种简便、高效的细胞外分泌表达体系亟待建立，将极大便捷后续的重组蛋白纯化，降低生产成本。

2、目前，仅少量文献报道了大肠杆菌细胞外重组蛋白的表达方法，且多为理化诱变的方法，筛选到胞外高产突变株，但该方法筛选过程复杂，机理不明，重复性差。理论上，使用大肠杆菌和沙门氏菌等革兰氏阴性菌的细胞外膜缺陷菌株，使周质空间蛋白部分释放到培养基中，如大肠杆菌的脂蛋白lpp基因突变可以将周质空间蛋白渗漏至培养基中。

3、大肠杆菌trxa基因产物－硫氧还蛋白(thioredoxin a，trxa)是一种分子量为12kd的氧化还原蛋白，普遍存在于生物体内。虽然trxa不属于分子伴侣的范畴，但它作为原核生物的组成蛋白具有与分子伴侣相似的功能。大肠杆菌trxa作为融合标签，在大肠杆菌中提高重组蛋白在细胞质中的可溶性表达水平，得到广泛的应用。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题为：提供一种大肠杆菌重组蛋白的细胞外分泌表达的方法。

2、本发明的技术方案为：硫氧还蛋白介导重组蛋白在大肠杆菌胞外分泌表达的方法，构建表达由ompa信号肽、trxa蛋白和目标蛋白组成的融合蛋白的表达载体，将表达载体转入大肠杆菌中进行表达培养。

3、进一步地，为了便于目标蛋白的分离回收，所述trxa蛋白和目标蛋白之间通过tev酶识别位点肽段连接。表达产物通过tev酶切即可得到目标蛋白。

4、进一步地，所述trxa蛋白与tev酶识别位点肽段之间通过甘氨酸柔性链连接。

5、进一步地，为了便于融合蛋白的提取纯化，ompa信号肽与trxa蛋白之间通过his标签蛋白连接。

6、进一步地，his标签蛋白与trxa蛋白之间之间通过甘氨酸柔性链连接。

7、进一步地，ompa信号肽的氨基酸序列如seq id no.1所示，trxa蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示，tev酶识别位点肽段为enlyfqg。

8、一种表达载体，所述表达载体含有编码ompa信号肽-his标签蛋白-柔性linker-trxa蛋白-柔性linker-tev酶识别位点肽段-protein融合蛋白的核苷酸序列；所述ompa信号肽的氨基酸序列如seq id no.1所示，trxa蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示，柔性linker两个或三个甘氨酸残基，tev酶识别位点肽段为enlyfqg，protein为任意目标蛋白或多肽。

9、进一步地，所述融合蛋白具有x+protein结构的氨基酸序列，其中x的氨基酸序列如seq id no.3所示。

10、进一步地，所述表达载体为pet系列载体。

11、一种含有上述所述表达载体的大肠杆菌工程菌。

12、将上述含有trxa融合蛋白的重组表达载体转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，然后培养至od600为0.6～0.8，加入终浓度为0.6mm的异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)诱导重组蛋白表达，30℃诱导表达24h，5000g、4℃离心10min离心去除菌体，获得积累目的蛋白的上清；且可通过温度的改变和信号肽的变化提高胞外分泌的表达量。

13、为使目的蛋白分泌到大肠杆菌的细胞外，目前的方法涉及宿主菌改造、筛选新的引导蛋、发酵过程调控等方面，成功的报道较少。硫氧还蛋白(trxa)目前主要用于大肠杆菌细胞内的融合表达，与目的蛋白融合提高其溶解性，本发明在研究过程中首次发现，trxa与适合的信号肽链接后不仅可以分泌到大肠杆菌的周质，而且还可以引导其c-末端的目的蛋白进一步跨大肠杆菌外膜分泌到培养基，实现细胞外分泌，且保留了其增强目的蛋白溶解性的功能；本发明提供的表达载体中外源蛋白基因与定位于周质空间的trxa编码序列相连，从而使胞内合成的外源蛋白通过信号肽定位于周质空间，后由trxa引导使目的蛋白实现跨大肠杆菌外膜分泌至培养基中；本发明还发现引导蛋白trxa对目的蛋白的活性影响较小，进一步拓展了其应用范围。

14、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

15、(1)本发明根据目前大肠杆菌在进行重组蛋白表达的过程中，多为胞内积累表达，会对菌体造成一定的代谢压力，且易形成不溶性的包涵体，在蛋白纯化过程中需要破碎细胞，操作复杂，成本高。设计信号肽和融合标签trxa与目的蛋白进行表达，该融合标签trxa可引导目的蛋白跨大肠杆菌的外膜分泌于培养基上清中。本发明的融合蛋白trxa介导目的蛋白分泌细胞外的体系，分泌表达效果显著，在未来可以运用该表达体系对目的蛋白实现胞外回收，简化了目的蛋白的分离纯化过程，降低了成本、提高了效益，是对大肠杆菌中重组蛋白表达方式的有益拓展，具有较大的市场价值与应用前景。

16、(2)本发明提供了分泌表达体系并且可以通过改变表达条件，以及信号肽的优化，进一步提高分泌表达量，该技术可广泛应用于重组蛋白的科学研究工作及工业化生产。

技术特征：

1.硫氧还蛋白介导重组蛋白在大肠杆菌胞外分泌表达的方法，其特征在于，构建表达由ompa信号肽、trxa蛋白和目标蛋白组成的融合蛋白的表达载体，将构建的表达载体转入大肠杆菌中进行表达培养。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述trxa蛋白和目标蛋白之间通过tev酶识别位点肽段连接。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述trxa蛋白与tev酶识别位点肽段之间通过甘氨酸柔性链连接。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，ompa信号肽与trxa蛋白之间通过his标签蛋白连接。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，his标签蛋白与trxa蛋白之间之间通过甘氨酸柔性链连接。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，ompa信号肽的氨基酸序列如seqid no.1所示，trxa蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示，tev酶识别位点肽段为enlyfqg。

7.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有编码ompa信号肽-his标签蛋白-柔性linker-trxa蛋白-柔性linker-tev酶识别位点肽段-protein融合蛋白的核苷酸序列；所述ompa信号肽的氨基酸序列如seq id no.1所示，trxa蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示，柔性linker两个或三个甘氨酸残基，tev酶识别位点肽段为enlyfqg，protein为任意目标蛋白或多肽。

8.根据权利要求7所述的表达载体，其特征在于，所述融合蛋白具有x+protein结构的氨基酸序列，其中x的氨基酸序列如seq id no.3所示。

9.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为pet系列载体。

10.一种含有权利要求7-9任一项所述表达载体的大肠杆菌工程菌。

技术总结
本发明公开了一种硫氧还蛋白介导重组蛋白在大肠杆菌胞外分泌表达的方法，构建表达由OmpA信号肽、TrxA蛋白和目标蛋白组成的融合蛋白的表达载体，将构建的表达载体转入大肠杆菌中进行表达培养。本发明设计信号肽和融合标签TrxA与目的蛋白进行表达，该融合标签TrxA可引导目的蛋白跨大肠杆菌的外膜分泌于培养基上清中，实现了重组蛋白的胞外表达。

技术研发人员：王声斌,黄文彬,彭阳选,赵芙蓉,牛放,王志鹏
受保护的技术使用者：华南农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13