一种用于肠道肿瘤细胞培养的水凝胶支架及其制备方法与流程

本发明涉及生物，具体涉及一种用于肠道肿瘤细胞培养的水凝胶支架及其制备方法。

背景技术：

1、肠道肿瘤的发展具有多阶段性、多种因素相互影响、多种生物途径的特点，其涉及的机制非常的复杂。目前对肠癌细胞培养的研究主要集中在2d层面，但是其中肠癌的生长过程同体内真实的肿瘤生长存在差异性，导致其研究层面存在局限性，这一点不如三维体系。这主要表现在以下几方面：一是单层细胞培养在揭示肠道肿瘤生物学行为方面同体内肿瘤真实的生理活性存在显著的差异性。三维水凝胶培养体系中细胞的恶性程度更高，其更加接近体内的结构环境；二是细胞在二维培养体系下生长无法长时间保持肠道肿瘤细胞的生物学特性，研究发现随着时间的延长，细胞的骨架发生重构、极性出现改变。多孔水凝胶载体不仅为肠道肿瘤细胞提供生长支撑，促进肠道肿瘤细胞的粘附和迁移，保障细胞之间营养物质的交换，同时还原了肿瘤内部细胞的真实生长环境，避免剪切力对细胞的损伤及营养物质缺失导致细胞的凋亡，使得细胞的活力增加；三是传统二维培养面积较为局限，细胞培养费时费力，培养效率较低；四是二维培养在细胞因子分泌、增殖相关蛋白表达等生化改变不同于体内。所以利用传统细胞培养皿培养的细胞和体内肿瘤生物学行为具有较大的差异；五是目前常用的水凝胶构建的材料包括胶原蛋白i型、明胶以及提取动物来源的基质，这些来自生物基的源材料容易携带动物来源的病原体，从而导致实验存在不可预知的风险。因此，本领域亟需制备一种用于肠道肿瘤细胞培养的三维培养基体系，来解决现有技术中的缺陷。

技术实现思路

1、针对上述技术的缺陷，本发明提供了一种用于肠道肿瘤细胞培养的水凝胶支架及其制备方法。

2、为了实现上述技术目的，本发明采用了以下技术方案：

3、本发明的第一方面提供了一种用于肠道肿瘤细胞培养的水凝胶支架材料的制备方法，包括以下步骤：

4、s1丝素蛋白溶液提取：

5、s11：将蚕茧壳剪成碎片后加入浓度为0.3～1.0g/100ml的碳酸钠溶液浸没蚕茧壳煮沸3遍以上，每次至少1个小时，然后自来水洗2-3次，再用去离子水冲洗2～4次,然后于50～70℃下烘干，烘干后的样品溶于8～10mol/l溴化锂的水溶液中，室温下充分搅拌进行溶解，冷却至室温后过滤，去除杂质，滤液装入截流分子量为3000～5000da透析袋透析袋中用去离子水透析2～5天，每6～8小时换一次液，制得丝素蛋白溶液；进一步的，所述样品和溴化锂的质量比为1:6～1:10；优选的，烘干温度为65℃；优选的，透析袋截流分子量3500da；

6、s2壳聚糖溶液的制备：称取2～5g壳聚糖粉末加入ph值为4～5、1～3％m/m冰醋酸溶液中，配制成2～5％m/m的壳聚糖醋酸溶液；

7、s3结肠脱细胞基质的制备：取裸鼠的结肠组织，流水中冲洗，并用镊子将结肠外的结缔组织、脂肪、淋巴结等钝性剥离后去除，反复用pbs进行清洗，将处理好的结肠横断剪成长条管状，黏膜层外翻，用1～3g/100ml sds和0.25～1g/100ml edta溶液浸泡，室温下摇床振荡10～15h，每3～6h换液1次，获得清洗后结肠组织，再用pbs浸泡洗涤10～15次，浸入0.5～2g/100ml triton x 100和0.25～1g/100ml edta，室温振荡10～15h，每2～4h换液1次，然后再用pbs冲洗10～15次，制得结肠脱细胞基质，pbs浸泡下4～8℃冰箱保存，然后用液氮冷萃，置于研钵中研磨成粉，制得脱细胞基质粉末。

8、s4丝素蛋白-壳聚糖-细胞外基质水凝胶材料的构建：

9、s41交联支架：取s1制备的丝素蛋白溶液、s2制备的壳聚糖溶液以及s3制备的脱细胞基质粉末按照重量份数1:1:0.5～1:1:2进行混合均匀，置于磁力搅拌机中进行搅拌，然后浸入含30～60mmol/l edc、15～20mmol/l nhs的95v/v％乙醇水溶液中交联20～30h，形成交联液，然后将所述交联液加入细胞培养板中，放入-30～-10℃冰箱中预冻20～30h，再放进-90～-70℃低温冰箱中冷冻20～30h，最后放入冷冻干燥机冷冻干燥40～60h，采用低温等离子消毒，即得；优选的，所述edc为50mmol/l；优选的，所述nhs为18mmol/l；优选的，交联24h；优选的，放入-20℃冰箱中预冻24h，再放进-80℃低温冰箱中冷冻48h；

10、本发明的第二方面提供了采用上述任一种方法制备的用于肠道肿瘤细胞培养的水凝胶支架；

11、进一步的，所述水凝胶内部分布均匀的孔隙结构，所述凝胶支架材料孔径为68μm～310μm；

12、进一步的，所述凝胶支架材料的孔隙率为68.69～91.91％；更进一步的，所述凝胶支架材料的孔隙率为68.69～91.91％；

13、本发明的第三方面提供了上述任一种肠道肿瘤细胞培养的水凝胶支架材料的使用方法，包括以下步骤：

14、将所述支架材料在细胞培养液中浸泡36～72小时，然后放入细胞培养板中，将适宜浓度的肿瘤细胞悬液滴加在上述材料上，再将上述培养板置入振荡器上振荡5～20min，使得细胞均匀地接种在支架材料上，然后置于培养箱中，进行培养。

技术特征：

1.一种用于肠道肿瘤细胞培养的水凝胶支架材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.一种用于肠道肿瘤细胞培养的水凝胶支架，其特征在于，由权利要求1所述方法制备。

3.根据权利要求2所述的水凝胶支架，其特征在于，所述水凝胶内部分布均匀的孔隙结构，所述凝胶支架材料孔径为68μm～310μm。

4.根据权利要求3所述的水凝胶支架，其特征在于，所述凝胶支架材料的孔隙率为68.69～91.91％；更进一步的，所述凝胶支架材料的孔隙率为68.69～91.91％。

5.一种权利要求2～4任一项所述肠道肿瘤细胞培养水凝胶支架的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

技术总结
本发明提供了一种用于肠道肿瘤细胞培养的水凝胶支架材料的制备方法，包括以下步骤：S1丝素蛋白溶液提取：S2壳聚糖溶液的制备：称取2～5g壳聚糖粉末加入pH值为4～5、1～3％m/m冰醋酸溶液中，配制成2～5％的壳聚糖醋酸溶液；S3结肠脱细胞基质的制备：S4丝素蛋白‑壳聚糖‑细胞外基质水凝胶材料的构建。并且以此方法构建了肠道水凝胶支架材料。采用不同质量比丝素蛋白溶液、壳聚糖溶液以及脱细胞基质粉末制备出孔隙率高、孔径适宜，吸水率高、吸附性强，稳定性能较好的支架材料。相比于其它体外肿瘤细胞培养方法，能很好的模拟体内肿瘤细胞的三维生长环境，可用于体外肿瘤细胞的培养；相比于动物培养，具有较低的培养成本，本发明凝胶材料具有良好的应用前景。

技术研发人员：陈亮,柯重伟,曹志鹏,韩善亮,李亮,李溪
受保护的技术使用者：上海市第五人民医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14