茎瘤芥BjuDA1R356K基因及其编码的蛋白与应用

本发明属于植物生物，具体涉及一种含单突变位点的榨菜bjuda1基因在调控榨菜瘤状茎膨大中的应用。

背景技术：

1、茎瘤芥(brassica juncea var.tumida tsen et lee)属于十字花科芸薹属作物，是芥菜的变种之一，瘤状茎是其主要的产品器官，以瘤状茎作为原料的加工成品即是世界三大名腌菜之一的“榨菜”，由于其质地嫩脆，风味鲜美，营养丰富，在川渝和江浙地区广泛种植(刘佩瑛，1996)。榨菜作为我国特色蔬菜，在主栽区重庆市已成为农村经济中产销规模最大、品牌知名度最高、辐射带动能力最强的优势特色产业。持续提高榨菜的产量，是增加农民收入的重要途径。

2、da1基因是李云海等(2008)于拟南芥中发现并克隆到的一个e3泛素连接酶的受体，atda1作为泛素受体蛋白，可以被多种e3泛素连接酶结合，或与下游的生长调节因子互作，对它们的活性进行调节，或降解相关底物，最终影响种子及器官大小，对种子和器官的大小起负调节作用。在拟南芥中，da1基因第358位氨基酸由精氨酸(r)突变成赖氨酸(k)时，突变体产生较大的种子和器官(peng et al.2015)。wang(2017)等通过在甘蓝型油菜中过表达atda1r358k发现外源基因的过表达降低了甘蓝型油菜bnda1的表达水平，转基因植株的种子、叶片、花和角果等器官都显著增大。

3、目前，da1基因在拟南芥、油菜、玉米和水稻中均有报道，但在榨菜中未见报道。利用同源克隆法在榨菜中克隆bjuda1基因，并通过体外人工合成基因技术引入突变位点，创制榨菜物种自身来源的点突变bjuda1r356k基因，再通过遗传工程培育转基因瘤状茎膨大的榨菜新种质，是一种值得探索的方法。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供茎瘤芥bjuda1r356k基因及其编码的蛋白与应用。

2、首先，本发明提供茎瘤芥bjuda1蛋白，其为：

3、1)由seq id no.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或

4、2)在seq id no.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。

5、其中，所述的蛋白质氨基酸序列的第356位由r(aga，精氨酸)突变为a(aaa，赖氨酸)，氨基酸序列如seq id no.4所示。

6、本发明还提供编码所述的茎瘤芥bjuda1的基因。

7、优选的，所述基因的序列如seq id no.1或seq id no.3所示。

8、本发明还提供含有所述基因的载体，宿主细胞和工程菌。

9、本发明还提供所述基因在促进茎瘤芥瘤状茎膨大的中的用途。

10、在本发明一个实施方案中，将所述基因转入茎瘤芥基因组中，并在转基因茎瘤芥中超量表达，促进茎瘤芥瘤状茎膨大。

11、本发明还提供一种促进茎瘤芥瘤状茎膨大的方法，其为将含有所述基因的载体转入所述茎瘤芥基因组中，并在转基因茎瘤芥中超量表达。

12、本发明采用同源克隆法，在榨菜中克隆了bjuda1基因，通过将该cdna第1067位碱基由g变为a，得到单突变位点的榨菜bjuda1r356k基因，再利用基因工程方法构建了bjuda1r356k基因的过表达载体，采用农杆菌介导法侵染野生型拟南芥的花序，最终筛选鉴定得到了t3代纯合转基因阳性株系，发现转基因阳性植株的种子和叶片器官显著增大；后续继续通过农杆菌介导法侵染榨菜下胚轴，将bjuda1r356k基因过表达载体遗传转化榨菜，所得阳性植株的瘤状茎显著增大。本发明创制的单突变位点的榨菜bjuda1r356k基因具有增大瘤状茎的特性，对于榨菜的增产具有极大的应用前景。

技术特征：

1.茎瘤芥bjuda1蛋白，其为：

2.如权利要求1所述的茎瘤芥bjuda1蛋白，所述的蛋白质氨基酸序列的第356位由r(aga，精氨酸)突变为a(aaa，赖氨酸)，氨基酸序列如seq id no.4所示。

3.编码权利要求1或2所述的茎瘤芥bjuda1的基因。

4.如权利要求2所述的基因，其特征在于，序列如seq id no.1或3所示。

5.含有权利要求3或4所述基因的载体。

6.含有权利要求5所述载体的宿主细胞。

7.含有权利要求3或4所述基因的工程菌。

8.权利要求3或4所述基因在促进茎瘤芥瘤状茎膨大的中的用途。

9.如权利要求7所述的用途，其特征在于，将所述基因转入茎瘤芥基因组中，并在转基因茎瘤芥中超量表达，促进茎瘤芥瘤状茎膨大。

10.一种促进茎瘤芥瘤状茎膨大的方法，其特征在于，将含有权利要求3或4所述基因的载体转入所述茎瘤芥基因组中，并在转基因茎瘤芥中超量表达。

技术总结
本发明涉及植物分子生物学领域，公开了一种含单突变位点的茎瘤芥(榨菜)BjuDA1基因及其克隆方法和应用。本发明通过同源克隆法得到茎瘤芥BjuDA1基因cDNA的编码区，通过将该cDNA第1067位碱基由G变为A，得到单突变位点的茎瘤芥BjuDA1R356K基因cDNA的编码区，序列全长如Seq ID No.3所示，其编码蛋白质的氨基酸序列如Seq ID No.4所示。通过农杆菌介导法，将BjuDA1R356K基因过表达载体，遗传转化野生型拟南芥，结果显示，过表达拟南芥阳性株系的种子和叶片器官显著增大；利用农杆菌介导法侵染茎瘤芥下胚轴，将BjuDA1R356K基因过表达载体，遗传转化茎瘤芥，所得阳性植株的瘤状茎显著增大。本发明创制的单突变位点的茎瘤芥BjuDA1R356K基因具有增大瘤状茎的特性，对于榨菜的增产具有极大的利用价值。

技术研发人员：魏大勇,赵飒,吴杰,管婧汝,汤青林,王志敏
受保护的技术使用者：西南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14