一种溶菌酶和溶葡萄球菌酶的融合蛋白及其制备方法和应用与流程

本发明涉及基因工程抗菌蛋白的制备领域，尤其涉及一种溶葡萄球菌酶-溶菌酶/溶菌酶-溶葡萄球菌酶融合蛋白及其制备方法和在金黄色葡萄球菌相关疾病方面的应用。

背景技术：

1、医疗和动物养殖领域抗生素的滥用造成耐药细菌的流行，对人类健康造成严重威胁。迫切需要研发用以替代抗生素的新型抗菌药物或饲料添加剂。溶菌酶和溶葡萄球菌酶是不同作用机制的具有杀菌活性的天然蛋白，其做为抗生素替代品已广泛应用于临床医药和食品工业。

2、溶菌酶(lysozyme)，又称胞壁质酶(muramidase)或n-乙酰胞壁质聚糖水解酶，是一种稳定的能水解细菌中黏多糖的碱性水解酶。溶菌酶主要通过破坏细胞壁中的n-乙酰胞壁酸和n-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶在自然中分布广泛，可分为微生物、噬菌体、植物和动物四种类型的溶菌酶。动物溶菌酶又可分为c型(鸡型)，g型(鹅型),i型(无脊椎动物型)三种类型。其中人源溶菌酶(hlm)就属于c型溶菌酶，主要分布于人体的泪液、唾液、肾脏、肠胃、血液等部位。相较于最先解析结构的鸡蛋清溶菌酶(lyz)，人源溶菌酶的活力是其4倍，具有更强的稳定性，适用的ph范围更宽泛。并且由于hlm来源于人体，不会在人体内产生任何的毒副作用和免疫排斥作用。

3、溶葡萄球菌酶(lst)是1964年从一株编号为nrrl b-2628的模拟葡萄球菌的培养物中发现并分离出来的一种可特异性水解细菌细胞壁肽聚糖交联结构甘氨酸五肽桥中的第2位和第3位甘氨酸形成的肽键的水解酶，因此具有破壁溶菌作用。由于作用靶点具有特殊性，所以溶葡萄球菌酶的长期使用不仅不会产生耐药性，而且能够有效杀灭已经产生其他抗生素抗药性的金黄色葡萄球菌菌株，例如耐甲氧西林和万古霉素的金葡菌。

4、由于作用机制不同，两者的抑菌谱也不同。因此人们通常将两者复配使用，例如专利cn 100335126c使用溶葡萄球菌酶、溶菌酶和抑菌肽复配的制剂用于牛子宫内膜炎的治疗和预防；专利cn 105769611 b在牙膏中添加溶菌酶和溶葡球菌酶用于强效去除牙菌斑；专利cn 111905098 a在复方液体凝胶中添加两种酶用于妇科生殖抑菌剂的制备。但是若通过复配的方式，需分别制备两种蛋白，这样的方式使得成本较高。而且复配所用的溶菌酶是鸡蛋清溶菌酶，其活性较人源溶菌酶活性低。因此开发出一种同时保留溶菌酶和溶葡萄球菌酶的生物活性的融合蛋白成为一种必要。本发明通过将人源溶菌酶和溶葡萄球菌酶融合表达，构建出同时保留两种酶活性的融合蛋白。众所周知，融合表达后酶的活力大概率情况下有不同程度的下降，但本发明通过调整融合蛋白的连接顺序，获得一种抗菌性能更优的融合蛋白。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种人溶菌酶和溶葡萄球菌酶融合蛋白及其制备方法和应用，该蛋白保留了溶菌酶和溶葡萄球菌酶的生物活性。出乎意料的是，采用本发明的设计方案，融合蛋白对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度较已有的复配方案的最小抑菌浓度更低。

2、本发明采用的技术方案是：

3、本发明提供了一种人溶菌酶和溶葡萄球菌酶的融合蛋白，所述融合蛋白是将溶葡萄球菌酶和溶菌酶用连接肽链接构成，即以溶葡萄球菌酶、连接肽、溶菌酶的顺序依次链接或者以溶菌酶、连接肽、溶葡萄球菌酶的顺序依次链接。

4、进一步地，本发明设计的溶葡萄球菌酶可以来源于伪中间葡萄球菌(staphylococcus pseudintermedius)或模拟葡萄球菌(staphylococcus simulus)，优选拟葡萄球菌来源的lst，其氨基酸序列如seq id no.1所示，核苷酸序列如seq id no.2所示。

5、进一步地，所述溶菌酶可以来源于原核生物或者真核生物，优选人源溶菌酶，其氨基酸序列如seq id no.3所示，核苷酸序列如seq id no.4所示。

6、进一步地，所述连接肽选自ggggs或(gs)n，优选(gs)n作为连接肽，优选地n＝1-5。

7、进一步地，当连接顺序依次为溶葡萄球菌酶、连接肽、人源溶菌酶时，融合蛋白记为lst-hlm，其氨基酸序列如seq id no.5所示，核苷酸序列如seq id no.6所示；当连接顺序为人源溶菌酶、连接肽、溶葡萄球菌酶时，所述融合蛋白记为hlm-lst，其氨基酸序列如seq id no.7所示，核苷酸序列如seq id no.8所示。

8、本发明提供了一种含有溶菌酶和溶葡萄球菌酶的融合蛋白编码基因的载体，表达载体包括但不限于酵母表达载体、大肠表达载体、枯草表达载体、昆虫表达载体、动物细胞表达载体、植物表达载体，更优选酵母表达载体。

9、本发明提供了一种溶菌酶和溶葡萄球菌酶的融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：

10、1)采用全基因合成的方式分别获得包含溶菌酶、溶葡萄球菌酶的基因序列，优选地以ppic9k作为载体；

11、2)使用引物分别扩增所述基因并引入连接肽序列，通过融合pcr的方式，按照溶葡萄球菌酶-连接肽-溶菌酶或溶菌酶-连接肽-溶葡萄球菌酶的顺序构建lst-hlm和hlm-lst表达载体，并将测序正确的表达载体转入毕赤酵母gs115的感受态，筛选阳性表达菌株；

12、3)挑取单克隆菌株进行摇瓶发酵，发酵期间补加甲醇作为碳源和诱导剂；收集发酵3d的上清进行透析，利用阳离子交换层析进行纯化；

13、任选地，还包括以金黄色葡萄球菌作为试验菌，使用96孔板测试溶葡萄球菌酶与人源溶菌酶融合蛋白的最小抑菌浓度(mic)；以及以溶壁微球菌作为受试菌测定hlm、hlm-lst和lst-hlm的溶菌酶活性；

14、本发明提供了一种人溶菌酶和溶葡萄球菌酶的融合蛋白在抑菌方面的应用，具体的，通过本发明的表皮溶葡萄球菌酶-溶菌酶/溶菌酶-溶葡萄球菌酶融合蛋白或含融合蛋白的产品可有效的抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。

15、本发明提供了一种溶葡萄球菌酶-溶菌酶/溶菌酶-溶葡萄球菌酶融合蛋白制备方法及其在抑菌方面的应用。该蛋白同时具有溶葡萄球菌酶和溶菌酶的活性，对于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有抑菌效果，并且其抑菌效果优于两个酶的复配溶液。

技术特征：

1.一种溶菌酶和溶葡萄球菌酶的融合蛋白，其特征在于是将溶葡萄球菌酶和溶菌酶用连接肽链接构成，即以溶葡萄球菌酶、连接肽、溶菌酶的顺序依次连接或者以溶菌酶、连接肽、溶葡萄球菌酶的顺序依次连接。

2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的溶葡萄球菌酶来源于伪中间葡萄球菌(staphylococcus pseudintermedius)或模拟葡萄球菌（staphylococcus simulus），优选拟葡萄球菌来源的lst，其氨基酸序列如seq id no.1所示。

3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述溶菌酶来源于原核生物或者真核生物，优选是人源溶菌酶，更具体地，其氨基酸序列如seq id no.3所示。

4.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述连接肽选自ggggs或(gs)n，优选(gs)n作为连接肽，n=1-5。

5.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no.5或seq idno.7所示。

6.编码如权利要求1至5任一项所述融合蛋白的基因，优选地，其核苷酸序列如seq idno.6或seq id no.8所示。

7.含有如权利要求6所述的基因的表达载体，包括但不限于酵母表达载体、大肠表达载体、枯草表达载体、昆虫表达载体、动物细胞表达载体、植物表达载体，优选酵母表达载体。

8.一种溶菌酶和溶葡萄球菌酶的融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：

9.如权利要求1至5任一项所述融合蛋白或其编码基因在制备抑菌产品中的应用，具体的抑菌是指抑制制金黄色葡萄球菌和/或大肠杆菌，更具体地，用于牛子宫内膜炎的治疗和预防；用于去除牙菌斑；用于妇科生殖抑菌剂的制备。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述产品是食品、药品、牙膏、护理产品，例如妇科生殖抑菌剂。

技术总结
本发明公开了一种溶葡萄球菌酶‑溶菌酶的融合蛋白。所述融合蛋白是将溶葡萄球菌、连接肽和人源溶菌酶串联而成，通过融合表达，该蛋白同时具有溶葡萄球菌酶和溶菌酶的活性，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有抑制效果。出乎意料的是，相较两者复配，融合蛋白对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度更低。并且由于融合蛋白的纯化工艺简单，其成本优势更加明显。可作为市面上现有溶菌酶和溶葡萄球菌酶复配试剂的替代品。

技术研发人员：张晓云,张晓立,李仲恺,王楠,李华珍,章家泉
受保护的技术使用者：百葵锐（深圳）生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/10/24