一种自分泌IL-21的NKL-IL21细胞系及其构建方法和应用

本发明涉及生物，具体涉及一种自分泌il-21的nkl-il21细胞系及其构建方法和应用。

背景技术：

1、公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

2、作为肿瘤治疗的主要手段，手术治疗、放射治疗以及化学治疗在传统的治疗方式中发挥着不可替代的作用，但是也存在着复发率高，毒副作用大，易产生耐药性等严重影响治疗效果的问题。随着医学技术的发展，相继出现的靶向药物和免疫药物，在提高治疗效果及降低副作用方面取得较大进步，但是仍然存在受众小、易耐药及治疗费用昂贵等缺点。因此，探索新的疗效更好、副作用更小、价格相对低廉的治疗方式和治疗药物仍然是肿瘤治疗的主要方向。

3、自然杀伤细胞(nk细胞)作为人体免疫系统中的第一道防线，发挥着免疫监视以及免疫防御的重要作用。与t细胞相比，nk细胞具有快速激活的优势，它无需抗原预先致敏，通过整合细胞表面大量的活化性和抑制性受体传递的信号，来实现迅速的免疫应答。nk细胞这种高效快速的致敏方式，使其在抗肿瘤免疫反应中占有重要地位。过继nk细胞疗法是细胞免疫疗法的一种，它通过分离自体或者异体的nk细胞，在体外进行激活或修饰后，回输到患者体内，对肿瘤细胞造成直接杀伤，或者间接引起抗肿瘤免疫反应。nkl细胞系是所有nk细胞系中与正常nk细胞自然特征最相似的细胞系，具有cd56dimcd16bright表型，因此，在抗肿瘤抗体存在时，也能通过adcc作用杀伤肿瘤细胞。关于该细胞系的研究相对较少，因此，对nkl细胞系的探索与开发对细胞治疗产品的扩展有重要意义。

4、肿瘤微环境中缺氧条件、低营养水平以及存在多种抑制因子的复杂恶劣微环境降低了nk细胞的激活，增加了nk细胞的凋亡和耗竭，造成处于其中的nk细胞失能，从而加快了肿瘤进展。针对这一情况，目前主要使用激活性细胞因子及单抗隆抗体、免疫检查点抑制剂以及过继转输细胞因子或car修饰nk细胞进行改进。il-21对多种免疫细胞均具有调控作用，可促进nk和cd8+t细胞的存活、增殖和细胞毒性。目前关于外源性添加的il-21对nk细胞作用的研究已有很多，但是外源性il-21在肿瘤微环境中的作用较为有限，无法高效抑制nk细胞的凋亡和耗竭，并且无法提高肿瘤浸润效果。并且，细胞因子半衰期短，而大剂量、重复多次全身给药会产生难以预料的毒性。

技术实现思路

1、为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种自分泌il-21的nkl-il21细胞系及其构建方法和应用。为解决外源性添加il-21的缺陷，本发明构建了人il-21(hil-21)基因修饰的nkl细胞系nkl-il21，以探究修饰之后自分泌的il-21对nkl细胞的作用以及作用机制，建立一种抗肿瘤作用更强的nk细胞系，并为克服肿瘤微环境、提高过继转输nk细胞的疗效提供新的思路。

2、为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：

3、第一方面，本发明提供了一种自分泌il-21的nkl-il21细胞系的构建方法，包括以下步骤：

4、s1、使用内切酶酶切核酸序列如seq id no.1所示的hil-21基因片段和慢病毒载体，通过连接酶将酶切后的hil-21基因和慢病毒载体连接，获得目的质粒；

5、s2、使用磷酸钙转染法将目的质粒与包装质粒转染至细胞中，培养后收取病毒液并浓缩纯化；

6、s3、使用浓缩纯化后的病毒液感染nkl细胞，将感染的nkl细胞进行扩增、流式细胞术分选，得到nkl-il21细胞系。

7、第二方面，本发明提供了一种自分泌il-21的nkl-il21细胞系，通过第一方面所述的构建方法获得。

8、第三方面，本发明提供了第二方面所述的nkl-il21细胞系在制备抗肿瘤产品中的应用。

9、上述本发明的一种或多种技术方案取得的有益效果如下：

10、本发明成功建立了可以表达、分泌il-21的nkl细胞，nkl-il21细胞中hil-21基因mrna水平上调约450倍，培养48小时，上清中的il-21量达到约400pg/ml。

11、体外实验证明，自分泌的il-21可以提高nkl细胞系增殖速度和细胞活力，提高nkl细胞处于g2期的比例。无血清饥饿实验表明，自分泌的il-21提高了nkl细胞的抗凋亡能力。自分泌的il-21提高nkl细胞对人肝癌细胞huh7、hep3b，人乳腺癌细胞mcf7以及人肺癌细胞a549的杀伤能力。nkl-il21细胞在肿瘤细胞的刺激下，其活化性受体nkp44明显上调，而抑制性受体nkg2a显著下调，且免疫抑制检查点tigit也上调。综上，自分泌的il-21促进nkl细胞的激活。

12、rt-qpcr和流式细胞术证明，hil-21的基因修饰上调了nkl细胞nkp46的表达。使用nkl-il21上清孵育人肝癌细胞huh7的实验表明，nkl-il21细胞上清通过tnf相关信号通路、凋亡及细胞粘附相关分子的表达，影响肿瘤细胞的凋亡、侵袭与迁移以及免疫逃逸过程。

13、裸鼠皮下荷瘤模型中观察到，nkl-il21细胞显著抑制了肿瘤细胞的生长，并提高了nkl细胞浸润肿瘤组织的数量。nkl-il21细胞治疗并不会产生明显的毒性，具有良好的安全性。

技术特征：

1.一种自分泌il-21的nkl-il21细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述hil-21基因片段的获取方法包括以下步骤：

3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，pcr上游引物的核酸序列如seq id no.2所示，，pcr下游引物的核酸序列如seq id no.3所示。

4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤s1中，所述慢病毒载体包括pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp，所述内切酶包括bamhⅰ和nheⅰ。

5.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤s1中，所述连接酶包括t4连接酶。

6.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤s2中，所述包装质粒包括pmdlg/rre、prsv-rev和p-vsv-g中的一种或多种。

7.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤s2中，培养时间为36-60小时。

8.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤s2中，使用peg8000进行浓缩纯化。

9.一种自分泌il-21的nkl-il21细胞系，其特征在于，通过权利要求1-8任一项所述的构建方法获得。

10.权利要求9所述的nkl-il21细胞系在制备抗肿瘤产品中的应用。

技术总结
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种自分泌IL‑21的NKL‑IL21细胞系及其构建方法和应用。自分泌IL‑21的NKL‑IL21细胞系的构建方法，包括以下步骤：S1、使用内切酶酶切核酸序列如SEQ ID NO.1所示的hIL‑21基因片段和慢病毒载体，通过连接酶将酶切后的hIL‑21基因和慢病毒载体连接，获得目的质粒；S2、使用磷酸钙转染法将目的质粒与包装质粒转染至细胞中，培养后收取病毒液并浓缩纯化；S3、使用浓缩纯化后的病毒液感染NKL细胞，将感染的NKL细胞进行扩增，得到NKL‑IL21细胞系。为解决外源性添加IL‑21的缺陷，本发明构建了人IL‑21(hIL‑21)基因修饰的NKL细胞系NKL‑IL21，以探究修饰之后自分泌的IL‑21对NKL细胞的作用以及作用机制，建立一种抗肿瘤作用更强的NK细胞系，并为克服肿瘤微环境、提高过继转输NK细胞的疗效提供新的思路。

技术研发人员：张建,张海荣,韩秋菊,赵华俊
受保护的技术使用者：山东大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14