重组辣根过氧化物酶同工酶C1A的制备方法与流程

本发明涉及生物工程领域，特别涉及重组辣根过氧化物酶同工酶c1a的制备方法。

背景技术：

1、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,hrp,ec 1.11.1.7)，因其最初发现于辣根植物的根部而被命名为辣根过氧化物酶。辣根过氧化物酶是辣根中所有hrp同工酶的统称，hrp c1a含量最为丰富。hrp c1a含有308个氨基酸，相对分子质量约为44000。其分子中含有两个不同的金属中心，正铁(fe iii)原卟啉环(通常称为“血红素基团”)和两个ca原子，两种金属离子对于酶的结构和功能完整性均必不可少。

2、辣根过氧化物酶因其比活高、耐热耐酸碱性好，且对污染物、盐度等均有较强的耐受性，因此被广泛应用于污水处理、食品、分析检测、医学诊断、有机合成等领域。在生物修复和废水处理中，辣根过氧化物酶以其高催化及环境友好的生物催化性能，被广泛应用于降解合成染料和清除废水中的酚类污染物的应用及研究中。在分析检测中，因hrp出色的活性及稳定性，使它几乎能够满足所有的分析系统要求(包括分析稳定性，灵敏度等)；并且由于其催化底物显色的能力，为荧光、发光等分光光度检测系统的使用成为可能；另外，其催化的反应为氧化还原过程，使其在电化学检测系统中也有所应用，其中最主要的就是开发电子传感器(包括对葡萄糖、乙醇、胆固醇、尿酸、丙酮酸、氨基酸和核酸的检测)。在医学诊断中，辣根过氧化物酶作为一种酶标记物在医学诊断和研究中有着广泛的应用，其可以和抗体、抗原以及其它分子共价偶联，使其在酶联免疫吸附分析和免疫组织化学技术中广泛应用，而这两种技术是免疫分析、核酸检测、组织和细胞化学应用中超灵敏检测的有效工具。在有机合成中，其主要作为一种温和的聚合催化剂，用辣根过氧化物酶和h2o2，可以将酚类和芳香族化合物合成多种均聚物和共聚物。

3、目前市售辣根过氧化物酶主要由辣根中提取而来，而辣根中的过氧化物酶种类繁多，因此提取到的也是其同工酶的混合物，使其无法应用于生物医药；而且植物中提取的操作复杂、效率低、产量受原材料质量的影响较大。利用基因工程技术、使用重组工程菌生产辣根过氧化物酶的方法可以很好的避免产物纯度低的弊端。现有的报道中，也曾公开一些原核表达辣根过氧化物酶的方法，但表达产物活性差，包涵体多不利于纯化，一些研究者曾尝试在真核体系下表达辣根过氧化物酶，但大多仅在是摇瓶水平研究，例如论文《辣根过氧化物酶hrpc1a的异源表达、固定化及染料脱色研究》中曾尝试开发辣根过氧化物酶hrp c1a的异源表达方法，但在毕赤酵母体系下无法表达，在大肠杆菌体系下表达产物为包涵体，无法大规模生产。因此，本领域亟需开发一种适宜规模制备的辣根过氧化物酶的制备方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种辣根过氧化物酶c1a的制备方法。

2、本发明的另一目的提供一种含有经上述方法制备获得的重组辣根过氧化物酶c1a的试剂盒。

3、为解决上述技术问题，本发明第一方面，提供了一种编码辣根过氧化物酶c1a蛋白的多核苷酸，所述多核苷酸经密码子优化，且所述多核苷酸选自以下任一种：

4、(i)如seq id no.2所示序列的多核苷酸；

5、(ii)与如seq id no.2所示序列的同源性大于95％的多核苷酸；和

6、(iii)与(i)或(ii)中所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸。

7、本发明第二方面，提供了一种表达载体，所述表达载体包括本发明第一方面提供的多核苷酸。

8、在一些优选的方案中，所述表达载体为毕赤酵母菌表达载体，更优选为ppic9、ppic9k、phil-s1、ppiczαa或pyam75p，最优选为ppic9k。

9、本发明第三方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括本发明第二方面提供的表达载体；或者

10、所述宿主细胞的基因组中整合有如本发明第一方面提供的多核苷酸。

11、在一些优选的方案中，所述宿主细胞为毕赤酵母菌(pichia.pastoris)。

12、在一些优选的方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌gs115或km71菌株。

13、本发明第四方面提供了一种制备辣根过氧化物酶c1a蛋白的方法，所述方法包括步骤：培养本发明第三方面所述的宿主细胞，以表达出目的蛋白；和

14、分离所述目的蛋白，即得所述辣根过氧化物酶c1a蛋白。

15、在一些优选的方案中，在bsm培养基中培养所述宿主细胞。

16、在一些优选的方案中，在ypd培养基中培养所述宿主细胞。

17、在一些优选的方案中，首先在ypd培养基中培养所述宿主细胞，得到单菌落后接种于bsm培养基中培养所述宿主细胞。

18、在一些优选的方案中，在25-30℃下培养所述宿主细胞。

19、在一些优选的方案中，在ph为4.8-5.5的培养基中培养所述宿主细胞。

20、在一些优选的方案中，在搅拌速度为200-1000rpm的条件下培养所述宿主细胞。

21、在一些优选的方案中，首先在含有甘油的培养基中培养所述宿主细胞，后加入甲醇继续培养，以表达出目的蛋白。

22、在一些优选的方案中，首先在含有甘油的培养基中培养所述宿主细胞，当od值达到180-240后继续培养至少0.8-1.2小时，再加入甲醇继续培养，以表达出目的蛋白。

23、在一些优选的方案中，甲醇的加入速率为2-7g/(l*h)。

24、在一些优选的方案中，加入甲醇后培养所述宿主细胞至少60小时，优选60-120小时。

25、在一些优选的方案中，所述分离所述目的蛋白的步骤包括：

26、将经破碎的目的蛋白上清液与流动相同时通过层析柱进行洗脱，收集洗脱液。

27、本发明第五方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：如本发明第一方面提供的的多核苷酸；或者

28、如本发明第二方面提供的表达载体；或者

29、如本发明第三方面所述的宿主细胞；或者

30、根据本发明第四方面所述的方法制备的辣根过氧化物酶c1a蛋白。

31、本发明相对于现有技术而言，至少具有下述优点：

32、(1)本发明中设计了适宜在毕赤酵母中表达的多核苷酸序列，并筛选得到可大量表达辣根过氧化物酶c1a蛋白的表达菌株；

33、(2)本发明中开发了生产重组辣根过氧化物酶c1a的工艺方法，该方法基于真核体系，培养表达量大，在诱导60-120h时，表达量可达到23u/ml；稳定性高，多次表达复现性良好，得到的产物活性好，适宜规模制备。

34、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

技术特征：

1.一种编码辣根过氧化物酶c1a蛋白的分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸经密码子优化，且所述多核苷酸选自以下任一种：

2.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括如权利要求1所述的多核苷酸。

3.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为毕赤酵母菌表达载体，优选为ppic9k。

4.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求2或3所述的表达载体；或者

5.一种制备辣根过氧化物酶c1a蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在bsm培养基中培养所述宿主细胞；

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，首先在ypd培养基中培养所述宿主细胞，得到单菌落后接种于bsm培养基中培养所述宿主细胞。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，首先在含有甘油的培养基中培养所述宿主细胞，后加入甲醇继续培养，以表达出目的蛋白。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在25-30℃下培养所述宿主细胞；

10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：如权利要求1所述的多核苷酸；或者

技术总结
本申请公开了一种重组辣根过氧化物酶同工酶C1A的制备方法。本申请中设计了适宜在毕赤酵母中表达的多核苷酸序列，并筛选得到可大量表达辣根过氧化物酶C1A蛋白的表达菌株；本申请还基于上述序列开发了生产重组辣根过氧化物酶C1A的工艺方法，该方法基于真核体系，培养表达量大，在诱导60‑120h时，表达量可达到23U/mL；稳定性高，多次表达复现性良好，得到的产物活性好，适宜规模制备。

技术研发人员：蒋析文,姚红涛,陈园园,雷泳森,王运龙
受保护的技术使用者：广州达安基因股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14