一种高通量快速选育高核糖核酸酵母的方法与流程

本发明涉及生物工程技术，具体涉及一种高通量筛选微生物菌株的方法。

背景技术：

1、核糖核酸(即rna，ribonucleic acid)是一种重要的生物大分子，其广泛运用于食品调味、营养保健、生物医药等领域。目前，rna的工业化生产主要是从纯培养的假丝酵母、酿酒酵母或者啤酒酵母泥中提取。酿酒酵母不产生任何毒素，是食品安全级(gras)微生物，且生长传代速度较快，易培养，营养价值，是公认最理想的rna来源。

2、由于酿酒酵母rna含量较低，平均在6％-8％，导致由酿酒酵母衍生出的rna、核苷酸等产品成本较高。为了降低生产成本，提高产品竞争力，需要进一步提高酵母菌株的rna含量。

技术实现思路

1、现有技术中采用传统筛选方法，难以实现大规模高效筛选，而且操作繁琐。针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种高效快速选育高核酸酵母的方法。

2、本发明提供一种高通量选育高核糖核酸酵母的方法，所述方法包括如下步骤：

3、(1)建立微生物突变体库；

4、(2)将步骤(1)得到的菌体复苏；

5、(3)突变体库适应性进化；

6、(4)进化文库高通量筛选得到高rna的酵母。

7、优选地，步骤(1)中，所述建立微生物突变体库采用化学诱变、物理诱变或者化学诱变和物理诱变的结合。

8、优选地，化学诱变剂为甲基磺酸乙酯、硫酸二乙酯、叠氮化钠中的一种或两种以上的组合；

9、优选地，化学诱变剂的作用浓度为1-6％(w/v)，

10、优选地，作用时间为0.5-2h。

11、优选地，物理诱变采用紫外辐射、常压室温等离子体中的一种或两种以上的组合，

12、优选地，物理诱变时间为30s-90s；

13、优选地，常压室温等离子体功率为80-120w，气流量为8-15l/min，优选地，常压室温等离子体功率为100w，气流量10l/min；

14、优选地，紫外辐射功率为15w-20w，照射距离为20-30cm。

15、优选地，步骤(2)中，将菌体在培养基中静置培养；

16、优选地，所述培养基为ypd培养基；

17、优选地，培养基ph 5.0-6.0；

18、优选地，培养温度为28-32℃；

19、优选地，培养时间为30-60min。

20、优选地，步骤(3)中，将步骤(2)得到的复苏的菌体在含有抑制物的进化培养基中培养，然后取培养液转接入新的进化培养基中进行培养，反复转接50-150次；

21、优选地，所述抑制物为6-杂氮尿嘧啶、8-氮鸟嘌呤、放线菌酮、6-巯基嘌呤、二氨基嘌呤、5-溴尿嘧啶、5-氟尿嘧啶中的一种或两种以上的组合；

22、优选地，转接后的培养基中抑制物浓度增高；

23、优选地，转接过程中，培养基中抑制物的浓度增高50-1000mg/l；

24、优选地，培养20-30h后进行转接，优选为24h；

25、优选地，培养温度为28-33℃，150-220rpm震荡培养；

26、优选地，抑制物浓度为50mg-1000mg/l，优选地，抑制物浓度为50mg-500mg/l；

27、优选地，抑制物初始浓度为50mg-100mg/l。

28、优选地，步骤(4)中，用rna荧光染料对诱变文库进行染色，选取荧光高的菌株即得到高rna的酵母；

29、优选地，所述rna荧光染料为rnaselecttm、hoechst 33258、quant-ittmrna reagent或溴化乙锭中的一种或两种以上的组合，优选为rnaselect。

30、优选地，所述方法还包括步骤(5)放大验证。

31、优选地，在发酵罐中对步骤(4)分选出的菌株进行发酵验证，测定其rna含量。

32、优选地，发酵培养基包含：以质量百分比计，葡萄糖2-6％，酵母浸出物0.5-2％，七水硫酸镁0.2-0.4％，七水硫酸锌0.2-0.4％，磷酸二氢钾0.5-1.2％，余量为水；

33、优选地，所述发酵培养基的ph为5.0-6.0，

34、优选地，发酵搅拌转速为300-600rpm，

35、优选地，发酵通气量为3-6l/min。

36、采用本发明提供的方法，可以高效地筛选得到高rna酵母菌株，快速选育出优势菌株，筛选出的优势菌株rna含量可以达到15％以上，菌体湿重可以达到200g/l以上，实现了高rna菌株的高密度发酵，这类菌株在实际生产过程中可以降低rna、核苷酸等相关产品的生产成本。

技术特征：

1.一种高通量选育高核糖核酸酵母的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述建立微生物突变体库采用化学诱变、物理诱变或者化学诱变和物理诱变的结合。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，化学诱变剂为甲基磺酸乙酯、硫酸二乙酯、叠氮化钠中的一种或两种以上的组合；

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，物理诱变采用紫外辐射、常压室温等离子体中的一种或两种以上的组合；优选地，物理诱变时间为30s-90s；

5.根据权利要求1-4任意一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，将菌体在培养基中静置培养；

6.根据权利要求1-5任意一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，将步骤(2)得到的复苏的菌体在含有抑制物的进化培养基中培养，然后取培养液转接入新的进化培养基中进行培养，反复转接50-150次；

7.根据权利要求1-6任意一项所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，用rna荧光染料对诱变文库进行染色，选取荧光高的菌株即得到高rna的酵母；

8.根据权利要求1-7任意一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤(5)放大验证。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，在发酵罐中对步骤(4)分选出的菌株进行发酵验证，测定其rna含量。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，发酵培养基包含：以质量百分比计，葡萄糖2-6％，酵母浸出物0.5-2％，七水硫酸镁0.2-0.4％，七水硫酸锌0.2-0.4％，磷酸二氢钾0.5-1.2％，余量为水；

技术总结
本发明提供一种高通量快速选育高核糖核酸酵母的方法。本发明提供的高通量选育高核糖核酸酵母的方法包括如下步骤：(1)建立微生物突变体库；(2)将步骤(1)得到的菌体复苏；(3)突变体库适应性进化；(4)进化文库高通量筛选得到高RNA的酵母。采用本发明提供的方法，可以高效地筛选得到高RNA酵母菌株，快速选育出优势菌株，筛选出的优势菌株RNA含量可以达到15％以上。

技术研发人员：伍业旭,肖明华,胡悦,张彦,雷森林,黄兴法
受保护的技术使用者：安琪酵母股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/5/6