圆斑蝰蛇磷脂酶A2特征多肽及其应用的制作方法

本发明涉及化学分析定性检测，尤其涉及圆斑蝰蛇磷脂酶a2特征多肽及其应用。

背景技术：

1、磷脂酶a2（phospholipase a2，pla2） 几乎存在于所有蛇毒液中，是生物体膜上一种重要的含钙金属酶,能特异性地水解sn-3-磷酸甘油酯2位上酯酰键生成游离的脂肪酸和溶血磷脂，广泛参与多种生物进程如磷脂代谢、免疫防御和信号传导，因而成为研究脂肪酸代谢、磷脂膜结构、磷脂与膜蛋白相互作用以及膜蛋白结构与功能的重要工具酶。圆斑蝰（daboia russelii siamensis），是蛇亚目蝰科蝰亚科蝰属下的一种有毒蝰蛇。研究表明圆斑蝰脂酶a2具有神经毒性、间接溶血，强肌坏死活性和细胞毒性。不同种属来源磷脂酶a2氨基酸序列存在差异，导致作用位点不同，表现出不一样的药理活性。目前市场中蛇毒血凝酶注射液的有效成分是从蝰蛇科蛇毒中提取的蛇毒血凝酶，可用于各种出血疾病。磷脂酶a2作为潜在的杂质，对制剂中磷脂酶控制对于提高药品质量，保证临床用药安全十分重要。目前磷脂酶a2检测多采用卵磷脂降解法检测磷脂酶活性，该方法操作复杂，灵敏度较低。因此开发一种简便快捷、具有种属鉴别的作用的方法对圆斑蝰蛇磷脂酶a2研究及蛇毒血凝酶注射液的质量控制十分重要。

2、液质联用技术拥有高灵敏度、高分辨率、高稳定性、高特异性和高效分离等特点，广泛应用于样品的定性定量分析之中。对于蛋白类样品的种属鉴别，重要是特征肽的筛选、前处理及质谱条件的优化，特征肽需要同时具有种属特异性、稳定性、质谱响应高等，后续针对该特征肽进行相应的前处理及液质条件优化。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明的发明目的是提供圆斑蝰磷脂酶a2特征多肽，所述特征多肽能够在表征样品中磷脂酶a2的种属来源中发挥重要作用，填补了圆斑蝰磷脂酶a2种属鉴别的空白。

2、为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、圆斑蝰磷脂酶a2特征多肽，所述特征多肽氨基酸序列为lidakqeafsffk。

4、一种上述圆斑蝰蛇磷脂酶a2特征多肽的应用，所述特征多肽可用于鉴别磷脂酶a2的种属来源。

5、进一步地，上述鉴别方法采用以下步骤：

6、（1）取待测样品溶解，进行酶解灭活后作为供试品溶液；

7、（2）水经过酶解处理，制备空白溶液；

8、（3）取步骤（1）所制备的供试品溶液及步骤（2）所制备的空白溶液注入液相色谱-质谱仪，采用电喷雾正离子模式，进行多反应监测，以质荷比m/z 772.41→294.18及772.41→342.20作为特征多肽的检测离子对，以确定待测样品中是否含有圆斑蝰蛇磷脂酶a2特征多肽中的特征多肽；

9、（4）如果检测到上述特征多肽,则证明待测样品中含有磷脂酶a2且来源于圆斑蝰蛇；反之若则证明待测样品中不含有来源于圆斑蝰蛇的磷脂酶a2。

10、进一步地，步骤（3）所述液相色谱-质谱仪中液相和质谱检测条件中，液相条件为：waters acquity uplc beh c18 色谱柱（50 mm*2.1 mm，1.7 μm）；流动相a：0.1%甲酸溶液流动相，b：0.1%甲酸乙腈；柱温：40℃；进样量：5 μl；流速：0.3 ml/min；按下表进行梯度洗脱：

11、

12、进一步地，步骤（2）的具体操作为：

13、①待测样品溶解：待测样品用1%碳酸氢铵配制为浓度1 µg/µl；

14、②酶解：取步骤①溶解后样品100 µl，加2 µg蛋白酶于37℃过夜酶解，酶解结束后高温灭活；

15、③离心：最后取步骤②酶解灭活的样品，12000 rpm离心10 min，取上清液即得待测样品。

16、优选地，所述的蛋白酶为胰蛋白酶。

17、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：由于已知白眉蝮蛇、矛头蝮蛇、尖吻蝮蛇等蛇毒的磷脂酶a2氨基酸序列中不含有本发明所述的特征多肽，因此，该特征多肽可用于检测待测样品中磷脂酶a2特征多肽的种属来源，检测准灵敏度高，一方面填补了蛇毒血凝酶注射液质量标准的空白，可以显著提高其质量控制水平，确保产品临床用药的有效性和安全性；另一方面也为圆斑蝰蛇磷脂酶a2更多药理学活性和临床应用的开发提供了保障。

技术特征：

1.圆斑蝰磷脂酶a2特征多肽，其特征在于，所述特征多肽氨基酸序列为lidakqeafsffk。

2.一种权利要求1所述圆斑蝰蛇磷脂酶a2特征多肽的应用，特征在于，所述特征多肽可用于鉴别磷脂酶a2的种属来源。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，鉴别采用以下步骤：

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（3）所述液相色谱-质谱仪中液相和质谱检测条件中，液相条件为：waters acquity uplc beh c18 色谱柱（50 mm*2.1 mm，1.7 μm）；流动相a：0.1%甲酸溶液流动相，b：0.1%甲酸乙腈；柱温：40℃；进样量：5 μl；流速：0.3ml/min；按下表进行梯度洗脱：

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（2）的具体操作为：

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的蛋白酶为胰蛋白酶。

技术总结
本发明涉及化学分析定性检测技术领域，尤其涉及圆斑蝰蛇磷脂酶A2特征多肽及其应用。所述特征多肽由特征多肽氨基酸序列为LIDAKQEAFSFFK。该特征多肽可用于检测待测样品中圆斑蝰蛇磷脂酶A2特征多肽种属来源，检测准确度高，可以显著提高蛇毒血凝酶注射液的质量控制水平，确保产品临床用药的有效性和安全性。另一方面也为圆斑蝰蛇磷脂酶A2更多药理学活性和临床应用的开发提供了保障。

技术研发人员：张冬梅,王聪聪,贺美莲,程春雷,杭宝建,杨明正,石峰,巩丽萍
受保护的技术使用者：山东省食品药品检验研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15