检测尘肺病肺部纤维化因子TGF-β基因位点多态性的引物、检测试剂盒及办法

本发明属于分子生物学领域，特别涉及到检测尘肺病肺部纤维化因子tgf-β基因rs1800469-509c/t位点多态性的引物、检测试剂盒及办法。

背景技术：

1、尘肺病是由于在职业活动或生活环境中长期吸入无机矿物质粉尘，粉尘在肺内潴留而引起的以肺组织弥漫性结节状或网格状纤维化为特征的一组疾病。现已成为世界主要职业病之一，同时也是中国职业病病种中占比最大、最严重的疾病。由于尘肺早期多无明显症状，且尘肺的发病机制尚未明确，在临床上主要依据职业接触史、影像学资料和肺功能检查来综合评定肺纤维化程度，因此该病一经诊断病情已进入纤维化晚期，此时病人肺组织已发生不可逆性纤维化，尚无良好的临床治疗手段可以阻断疾病的发展进程。寻找尘肺早期诊断和肺纤维化进程评定的敏感标志物，从发病源头进行一级预防对保护矿工的健康具有重要意义。要想解决我国尘肺病危害的关键问题在预防，可靠性强、灵敏度高、可用于临床诊断和早期预防的生物标志物是精准防控尘肺的关键。

2、本发明从易感基因多态性鉴定出发，通过rflp-pcr的方法，对tgf-β基因的位点多态性鉴定，研发出的tgf-β基因检测试剂盒可对尘肺病人易感基因位点实现快速高效检测，以期从基因层面对尘肺病进行早期预防，在建立起基因-环境完善的尘肺病预警体系，对于携带高风险基因的接尘人群，提出更精准的防护意见，包括加强定期体检，及时发现尘肺患者，特别是具有易感因素的人群(尘肺期别高、接尘工龄长、接尘年代早、掘进工等)，应作为预防重点，特别加以关注，以达到控制、降低尘肺患者的目的。因此，易感基因及其单核苷酸多态性的早期筛查可为尘肺病的分子遗传学机制研究、个体危险度评估和疾病诊疗提供线索和理论依据。

3、以往tgf-β基因位点多态性的检测的主要方法有taqman法、质谱法、芯片法等，其耗时时间长、花费高。taqman法检测灵敏度高适用于大样本、少位点,价格较高；质谱法准确性也较高但适用于大样本,多位点检测；芯片法准确度较低适用于超多位点检测.质谱法和芯片法都需配备价格昂贵的大型仪器设备,实验条件要求高,导致检测成本提升。

技术实现思路

1、为解决以上技术问题，本发明提供了一种用于检测尘肺病肺部纤维化因子tgf-βrs1800469-509c/t位点多态性的引物、检测试剂盒及办法，通过易感位点基因型的电泳检测，实现多位点、快速、便捷、低成本的易感基因的单核苷酸多态性突变情况检测。

2、本发明提供了一种用于检测尘肺病肺部纤维化因子tgf-βrs1800469-509c/t位点多态性的特异性引物，该组pcr反应的特异性正向、反向引物为：

3、正向引物：tgtggggatagataagacggtggg

4、反向引物：gagggtgtcagtgggaggaggg

5、本发明提供了一种用于检测尘肺病肺部纤维化因子tgf-βrs1800469-509c/t位点多态性的检测试剂盒，检测试剂盒的上表面开设有若干凹槽形成若干容器孔，所述若干容器孔分别卡接有若干试剂瓶和\或管；

6、所述试剂瓶和\或管分别用于盛放免提取核酸裂解液、2×pcr master mix、1对引物、1组酶、buffer、ddh2o中的任意一种或多种。

7、进一步的，所述pcr检测试剂盒铰接有上盖板；

8、当所述上盖板覆盖于所述pcr检测试剂盒的上表面时，所述pcr检测试剂盒内部呈封闭状态。

9、进一步的，所述2×pcr master mix包括2×taqdna polymerase，2×pcr buffer，2×dntp。

10、进一步的，所述1组酶包括bsu36i酶。

11、进一步的，所述1对引物包括

12、正向引物：tgtggggatagataagacggtggg

13、反向引物：gagggtgtcagtgggaggaggg

14、tgf-β易感位点位于rs1800469，位点多态性为c/t，在位点等位基因为t可被bsu36i酶酶切。

15、进一步的，免提取核酸裂解液是一种dna lysis液，可以在55℃水浴处理待测dna样本5min，即可作为pcr反应的dna。

16、进一步的，所述试剂盒pcr反应体系中，扩增覆盖tgf-β基因的正、反向引物工作浓度均为0.5ul。

17、为解决以上技术问题，本发明提供了一种检测尘肺病肺部纤维化因子相关基因tgf-βrs1800469-509c/t位点多态性的方法,包括以下步骤:

18、(1)利用免提取核酸裂解液处理待测样本dna；

19、(2)利用1对特异性pcr正、反向引物对dna样本分别进行扩增,获得覆盖检测tgf-β基因-509c/t位点的扩增产物；所述1对特异性pcr引物的核苷酸序列为:

20、正向引物：tgtggggatagataagacggtggg

21、反向引物：gagggtgtcagtgggaggaggg

22、(3)将步骤(2)获得的扩增产物进行限制性核酸内切酶处理，获得酶切处理样本，通过琼脂糖凝胶电泳观测到片段长度及数目。

23、具体的，pcr扩增反应体系包括:2×pcr master mix 5μl，待测样本dna 1μl，正、反向引物0.5ul，最后ddh2o补至10μl体系。pcr扩增条件为95℃预变性5min；95℃30s,68℃30s,72℃30s,共36个循环；72℃延伸5min,最后放置4℃待使用。

24、具体的，限制性核酸内切酶的反应条件为:bsu36i酶1μl，buffer2ul，pcr扩增产物10ul，最后ddh2o补至30μl，放置水浴37℃处理1h，最后放置4℃待使用。

25、本发明具有以下有益效果：

26、(1)根据人类基因组的保守基因序列设计引物，挑选的限制性核酸内切酶酶切效率高与常规的测序方法相比采用本发明的试剂盒可以更迅速准确的确定个体tgf-β基因-509c/t位点突变情况，具有较高的特异性和敏感性，可以大批次进行准确检测，且过程简单易操作。

27、(2)本发明可对人类dna样本进行快速检测，试剂盒提供的试剂中，无感染性、无生物安全隐患成分，使用安全性很高。

28、本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在所写的说明书、权利要求书、以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。

29、下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

技术特征：

1.一组用于检测尘肺病肺部纤维化因子tgf-βrs1800469-509c/t位点多态性的特异性引物，其特征在于,包括扩增覆盖tgf-β基因的-509c/t位点正、反向引物,其核苷酸序列为:正向引物：tgtggggatagataagacggtggg

2.一组用于检测尘肺病肺部纤维化因子tgf-βrs1800469-509c/t位点多态性的特异性酶，其特征在于,包括限制性核酸内切酶酶切识别位点位于tgf-β基因的-509c/t位点,其酶切识别位点为cc/tc，具体位置见附图2。

3.一组用于检测尘肺病肺部纤维化因子tgf-βrs1800469-509c/t位点多态性的检测试剂盒其特征在于，所述试剂盒包括免提取核酸裂解液、pcr扩增反应试剂、限制性核酸内切酶反应试剂；其中pcr反应试剂还包括权利要求1所述的一组扩增覆盖tgf-β基因的-509c/t位点正、反向引物,其核苷酸序列为:

4.根据权利要求2所述的用于检测尘肺病肺部纤维化因子tgf-βrs1800469-509c/t位点多态性的试剂盒,其特征在于,所述pcr扩增反应试剂包括:2×pcr master mix,ddh2o,待测样本dna。

5.根据权利要求2所述的用于检测尘肺病肺部纤维化因子tgf-βrs1800469-509c/t位点多态性的试剂盒,其特征在于,所述限制性核酸内切酶反应试剂包括:bsu36i酶,限制性核酸内切酶反应buffer,pcr扩增反应产物,ddh2o。

6.根据权利要求2所述的用于检测尘肺病肺部纤维化因子tgf-βrs1800469-509c/t位点多态性的试剂盒,其特征在于,所述引物组的正、反向引物工作浓度均为0.5ul。

7.一种用于检测尘肺病肺部纤维化因子tgf-βrs1800469-509c/t位点多态性的方法,包括以下步骤:

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)是在反应体系中进行扩增，所述pcr扩增反应体系包括:2×pcr master mix 5μl，待测样本dna 1μl，正、反向引物0.5ul，最后ddh2o补至10μl体系。pcr扩增条件为95℃预变性5min；95℃30s,68℃30s,72℃30s,共36个循环；72℃延伸5min,最后放置4℃待使用。

9.根据权利要求7所述的方法,其特征在于，所述步骤(3)是在反应体系中进行酶切，限制性核酸内切酶的反应条件为:bsu36i酶1μl，buffer2ul，pcr扩增产物10ul，最后ddh2o补至30μl，放置水浴37℃处理1h，最后放置4℃待使用。

技术总结
本发明公开了检测尘肺病肺部纤维化TGF‑β基因位点多态性的引物、检测试剂盒及办法，特异性引物包括扩增覆盖TGF‑β基因rs1800469‑509C/T位点；检测试剂盒的上表面开设有若干凹槽形成若干容器孔，所述若干容器孔分别卡接有若干试剂瓶和\或管和卡槽；检测试剂盒包括一对PCR引物，Bsu36I酶，2×PCR Master Mix，TGF‑β基因型对照卡片中的任意一种或多种。本发明可用于实验室、医院等场景检测TGF‑β的基因‑509C/T位点的多态性及基因型情况，本发明提供的一对PCR引物和方法储存时间长，操作简单，特异性强，实现TGF‑β‑509C/T位点的多态性及基因型情况的快速、准确、便捷、低成本检测。

技术研发人员：王曙光,陈亦然,金雨婷
受保护的技术使用者：安徽理工大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15