一株图库曼拟无枝菌酸菌KC316及其应用

本发明涉及微生物工程，具体涉及一株图库曼拟无枝菌酸菌kc 316及其应用。

背景技术：

1、拟无枝酸菌属(amycolatopsis)属于假诺卡氏菌科，该属许多菌株的次级产物都有新颖的生物活性,大部分是抗菌能力较强的重要抗生素,因而被广泛应用于抗生素的工业生产。图库曼拟无枝菌酸菌(amycolatopsis tucumanensis)于2010年被albarracín等人报道，其细胞内能够合成一种低分子量的富含半胱氨酸的蛋白，该蛋白与铜有较强的结合能力，因而有较好的胞内铜累积能力，可有效减少铜污染地区植物的有效铜含量，用于治理环境铜染污。

2、近年来，长期的单一种植以及集约化大棚蔬菜种植的迅速发展导致根结线虫的频发。我国每年的根结线虫危害直接经济损失高达500亿元，使得农业发展受到严重制约。根结线虫通过口针破坏根部的表皮细胞，使寄主植物的组织细胞发生病变，产生巨型细胞，形成根结。同时造成植物的正常生理代谢受阻，植物水分和无机盐吸收不足，出现植株萎蔫，叶片黄化，物候期延迟，产量下降等现象。此外，根结线虫的口针给寄主植物的表皮细胞带来机械损伤，为土壤中的其他病原菌提供了侵染途径，造成多种病原菌入侵寄主植物，形成复合病害，造成植物生长缓慢、落叶、甚至枯死。

3、目前，根结线虫的防治措施主要有农业防治、物理防治、化学防治和生物防治。农业防治主要通过轮作、间作、土壤翻耕、嫁接抗性砧木田间管理等方式防治根结线虫，然而农业防治受土地资源，砧木数量限制，很难大规模推行。物理防治主要通过阳光消毒、土壤热水处理等方式消除土壤中的线虫卵，但其同时也消灭了土壤中部分有益菌群，破坏了土壤团粒结构及生态系统。化学防治是目前应用较广的线虫防治手段，主要通过溴甲烷、噻唑膦、克百威、涕灭威等人工合成的化学杀虫剂进行防治，但长期使用化学药剂容易引发线虫抗性及环境污染等问题，残留药剂进入食物链对人和动物造成毒害，因而很多化学杀线虫药剂如克百威、溴甲烷熏蒸剂等已被国家明文禁止使用。生物防治是利用植物、微生物或其产生的代谢产物来防治根结线虫，既降低了化学防治的毒性残留和对环境的危害等问题，又能达到易降解且不易产生抗药性的防治效果，且部分功能微生物在作物生长发育方面还表现出促进作用。因此，筛选出新的具有杀线虫活性和促生作用的双功能菌株对农业的可持续发展具有重要意义。

4、经检索，未找到有关图库曼拟无枝菌酸菌有杀线虫活性并促植物生长的功能的报道。

技术实现思路

1、针对以上技术问题，本发明拟提供一株图库曼拟无枝菌酸菌kc 316及其应用。

2、本发明提供一株图库曼拟无枝菌酸菌，其分类名称为(amycolatopsistucumanensis)kc 316，已于2022年11月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，其保藏登记号为cgmcc no.26012。

3、本发明还保护图库曼拟无枝菌酸菌的发酵产物的制备方法，包括以下步骤：

4、s1菌株的活化，将甘油管保藏的图库曼拟无枝菌酸菌菌株，平板划线到改良国际链霉菌2号培养基(i sp 2)固体培养基上，培养3-5d；

5、s2种子液的制备，将s1活化好的图库曼拟无枝菌酸菌单菌落接种到种子培养基，25-40℃、80-200rpm摇床振荡培养，发酵3-5d，制成种子液；

6、s3大规模发酵，取s2中制备的5ml种子液接种到100ml发酵培养基中，25-40℃、80-200rpm振荡培养，摇床发酵5-9d，得到发酵液；

7、s4离心，将s3得到的发酵液4000rpm离心10mi n，收集得到发酵液上清液；

8、s5发酵产物的提取，将上述步骤s4中得到的发酵液上清液，采用有机试剂进行萃取，将萃取液进行减压蒸馏以去除有机溶剂，得到的产物即为发酵粗提物。

9、进一步地，所述的s5中的具体方法为：用等体积乙酸乙酯进行萃取，静置待水相与乙酸乙酯相分层后，收集乙酸乙酯相；剩余的水相再次用等体积乙酸乙酯进行萃取，静置待水相与乙酸乙酯相分层后，收集位于上层的乙酸乙酯相；剩余的水相第三次用等体积乙酸乙酯进行萃取，静置待水相与乙酸乙酯相分层后，收集乙酸乙酯相；合并三次萃取得到的乙酸乙酯相，40-50℃减压蒸馏以除去有机溶剂，得到的物质即为发酵粗提物。

10、进一步地，步骤s3中的发酵培养基的制备方法为：5g葡萄糖、5g酵母浸提物、5g麦芽提取粉，溶于水，调ph至7.5，琼脂18-20g，用水定容至1l，121℃灭菌15分钟。

11、优选地，步骤s2中的种子培养基的制备方法为：将5g酵母浸提物、10g麦芽浸提物和4g葡萄糖溶于水，调ph至7.0-7.2，用水定容至1l，121℃灭菌30分钟，所述的种子液od600nm为1.6-2.0。

12、优选地，步骤s1中所述改良国际链霉菌2号培养基(i sp 2)的制备方法如下：5g葡萄糖、5g酵母浸提物、5g麦芽提取粉，调ph至7.5，用水定容至1l。

13、优选地，步骤s1中的固体培养基的制备方法为：5g葡萄糖、5g酵母浸提物、5g麦芽提取粉，溶于水，调ph至7.5，琼脂18-20g，用水定容至1l，121℃灭菌15分钟。

14、本发明还保护所述的图库曼拟无枝菌酸菌的发酵产物在制备杀线虫菌剂中的应用。

15、本发明还保护所述的图库曼拟无枝菌酸菌的发酵产物在制备促作物生长菌剂中的应用。

16、优选地，所述的线虫为根结线虫。

17、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

18、(1)本发明提供了一种图库曼拟无枝菌酸菌kc 316，该菌株首次被报道可用于线虫病害的防治。

19、(2)本发明的图库曼拟无枝菌酸菌kc 316的发酵产物除杀线虫外，还同时有促进植物生长的作用。

20、(3)与目前使用化学合成农药防治相比，由于本发明的发明的发酵菌液来自于自然环境，具有高效、低毒、不污染环境和不易产生抗药性等优点。

技术特征：

1.一株图库曼拟无枝菌酸菌，其特征在于：其分类名称为(amycolatopsistucumanensis)kc 316，已于2022年11月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，其保藏登记号为cgmcc no.26012。

2.一种如权利要求1所述的图库曼拟无枝菌酸菌的发酵产物，其制备方法包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的图库曼拟无枝菌酸菌的发酵产物，其特征在于：所述的s5中的具体方法为：用等体积乙酸乙酯进行萃取，静置待水相与乙酸乙酯相分层后，收集乙酸乙酯相；剩余的水相再次用等体积乙酸乙酯进行萃取，静置待水相与乙酸乙酯相分层后，收集位于上层的乙酸乙酯相；剩余的水相第三次用等体积乙酸乙酯进行萃取，静置待水相与乙酸乙酯相分层后，收集乙酸乙酯相；合并三次萃取得到的乙酸乙酯相，40-50℃减压蒸馏以除去有机溶剂，得到的物质即为发酵粗提物。

4.根据权利要求2所述的图库曼拟无枝菌酸菌的发酵产物，其特征在于：步骤s3中的发酵培养基的制备方法为：5g葡萄糖、5g酵母浸提物、5g麦芽提取粉，溶于水，调ph至7.5，琼脂18-20g，用水定容至1l，121℃灭菌15分钟。

5.根据权利要求2所述的图库曼拟无枝菌酸菌的发酵产物，其特征在于：步骤s2中的种子培养基的制备方法为：将5g酵母浸提物、10g麦芽浸提物和4g葡萄糖溶于水，调ph至7.0-7.2，用水定容至1l，121℃灭菌30分钟，所述的种子液od600nm为1.6-2.0。

6.根据权利要求2所述的图库曼拟无枝菌酸菌的发酵产物，其特征在于：步骤s1中所述改良国际链霉菌2号培养基(isp 2)的制备方法如下：5g葡萄糖、5g酵母浸提物、5g麦芽提取粉，调ph至7.5，用水定容至1l。

7.根据权利要求2所述的图库曼拟无枝菌酸菌的发酵产物，其特征在于：步骤s1中的固体培养基的制备方法为：5g葡萄糖、5g酵母浸提物、5g麦芽提取粉，溶于水，调ph至7.5，琼脂18-20g，用水定容至1l，121℃灭菌15分钟。

8.根据权利要求2-7任一权利要求所述的图库曼拟无枝菌酸菌的发酵产物在制备杀线虫菌剂中的应用。

9.根据权利要求2-7任一权利要求所述的图库曼拟无枝菌酸菌的发酵产物在制备促作物生长菌剂中的应用。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的线虫为根结线虫。

技术总结
本发明公开了一株图库曼拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis tucumanensis)KC 316及其应用，该菌的微生物保藏登记号为CGMCC No.26012。本发明提供了制备图库曼拟无枝菌酸菌KC 316发酵产物的制备方法。实验证明图库曼拟无枝菌酸菌KC 316的发酵产物能促进作物生长，具有高杀根结线虫的活性。本发明筛选出的菌株首次被报道可用于线虫病害的防治，同时还有促进植物生长的作用。与目前使用的化学合成农药防治相比，由于其来自于自然环境，具有高效、低毒、不污染环境和不易产生抗药性等优点，对农业的可持续发展具有重要的意义。

技术研发人员：曹艳茹,朱国兴,陈秀,孔德军,张悦,何江波,刘子超,侯秀丽,苏源
受保护的技术使用者：昆明学院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13