耐酸性提高的β-甘露聚糖酶突变体N186D及其制备和应用

本发明涉及基因工程，具体涉及一种耐酸性提高的β-甘露聚糖酶突变体n186d及其制备和应用。

背景技术：

1、β-甘露聚糖酶(ec 3.2.1.78)是一类半纤维素酶，能特异性地催化β-1,4糖苷键断裂，其作为绿色、环保、经济的饲用酶添加剂之一被广泛应用到动物养殖行业以此提高生产性能，降低养殖成本。β-甘露聚糖酶可以酶解非常规饲料原料中的抗营养因子甘露聚糖，生成动物可吸收利用的低聚寡糖，起到促进肠道益生菌增殖，抑制有害菌定殖的作用。通常情况下，动物胃肠道呈现弱酸环境，ph在2.0～5.5之间，因此，β-甘露聚糖酶需具备能在酸性介质中稳定，高效地发挥催化活性的特征。但目前现有的β-甘露聚糖酶的酸耐受性低，仍难以完全满足动物养殖和工业生产的需要。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种耐酸性提高的β-甘露聚糖酶突变体n186d及其制备和应用，为解决β-甘露聚糖酶酸耐受性低，难以满足动物养殖和工业应用的需要等问题，本发明提供的β-甘露聚糖酶突变体n186d具有较高的酸耐受性，可被应用于动物养殖和工业生产中，具备显著的应用前景。

2、为了达到上述目的，本发明提供了一种耐酸性提高的β-甘露聚糖酶突变体n186d，该突变体n186d的氨基酸序列如seq id no.3所示，该突变体是由氨基酸序列如seq idno.1所示的β-甘露聚糖酶的第186位的天冬酰胺突变为天冬氨酸所得，与氨基酸序列如seqid no.1所示的野生型β-甘露聚糖酶相比，该突变体在ph为4～6时的耐酸性提高，尤其在ph＝4的缓冲液中耐受1h后，n186d还保留74.6％的活性。

3、本发明提供的β-甘露聚糖酶突变体n186d可被应用于养殖业中，尤其可用于制备动物饲料。

4、本发明提供的β-甘露聚糖酶突变体n186d可被应用于β-甘露聚糖的工业生产中。

5、本发明还提供了该β-甘露聚糖酶突变体n186d的编码基因，其核苷酸序列如seqid no.4所示。

6、本发明还提供了一种包含上述编码基因的重组质粒。

7、优选地，上述的重组质粒的空载体选自pet-28a(+)。

8、本发明还提供了一种包含上述重组质粒的重组表达菌。

9、优选地，上述的表达菌选自大肠杆菌bl21(de3)。

10、本发明还提供了一种上述β-甘露聚糖酶突变体n186d的制备方法，包含如下步骤：

11、s1.以含有核苷酸序列如seq id no.2所示的野生型β-甘露聚糖酶编码基因的载体为模板，以核苷酸序列如seq id no.15和seq id no.16所示的位点突变引物进行突变扩增，获得包含核苷酸序列如seq id no.4所示突变体编码基因的重组质粒；

12、s2.将步骤s1所得的重组质粒转入表达菌中，表达并纯化，得到如上所述的β-甘露聚糖酶突变体n186d。

13、本发明的耐酸性提高的β-甘露聚糖酶突变体n186d及其制备和应用，解决了现有的β-甘露聚糖酶酸耐受性低，难以满足动物养殖和工业应用的需要等问题，具有以下优点：

14、本发明通过对氨基酸序列如seq id no.1所示的野生型β-甘露聚糖酶的第186位的天冬酰胺突变为天冬氨酸，所得的突变体n186d和野生型β-甘露聚糖酶的最适反应ph为6.5。本发明提供的β-甘露聚糖酶突变体n186d具有较高的酸耐受性，在ph为4的缓冲液中耐受1h后，突变体n186d还能保留74.6％的活性，而野生型β-甘露聚糖酶仅保留55.92％的活性，这种高酸耐受性的β-甘露聚糖酶可被应用于动物养殖和工业生产中，具备显著的应用前景。

技术特征：

1.一种耐酸性提高的β-甘露聚糖酶突变体n186d，其特征在于，该突变体n186d的氨基酸序列如seq id no.3所示，与氨基酸序列如seq id no.1所示的野生型β-甘露聚糖酶相比，该突变体在ph为4～6时的耐酸性提高。

2.如权利要求1所述的β-甘露聚糖酶突变体n186d在养殖业中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的应用包括制备动物饲料。

4.如权利要求1所述的β-甘露聚糖酶突变体n186d在β-甘露聚糖工业生产中的应用。

5.如权利要求1所述的β-甘露聚糖酶突变体n186d的编码基因，其特征在于，该编码基因的核苷酸序列如seq id no.4所示。

6.一种包含如权利要求5所述编码基因的重组质粒。

7.根据权利要求6所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒选用pet-28a(+)。

8.一种包含如权利要求6所述重组质粒的重组表达菌。

9.根据权利要求8所述的重组表达菌，其特征在于，所述重组表达菌选用大肠杆菌bl21(de3)。

10.如权利要求1所述β-甘露聚糖酶突变体n186d的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：

技术总结
本发明公开了一种耐酸性提高的β‑甘露聚糖酶突变体N186D及其制备和应用，涉及基因工程技术领域。本发明提供的突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码该突变体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，该突变体是由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生型β‑甘露聚糖酶突变所得，该突变体N186D的最适反应pH为6.5，在pH为4的缓冲液中耐受1h后，N186D保留74.6％的活性，而野生型β‑甘露聚糖酶仅保留55.92％的活性。本发明提供的耐酸性提高的β‑甘露聚糖酶突变体N186D在动物养殖和工业生产中具有较好的应用前景。

技术研发人员：黄遵锡,者园园,苗华彪,杨金茹
受保护的技术使用者：云南师范大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13