一种桃实生种子的瞬时转化方法及其应用

本发明属于生物，涉及一种桃实生种子的瞬时转化方法及其应用。

背景技术：

1、桃是我国重要的经济果树，其果实味美多汁，深受消费者喜爱。随着桃基因组测序工作的完成以及高通量测序技术的发展，为研究与农艺性状和代谢途径有关的候选基因提供了可能性。然而，由于缺少成熟的桃遗传转化技术，使得桃基因功能以及分子育种的相关研究严重地落后于其它果树作物，如葡萄、苹果、柑橘、梨等。因此，在稳定转化技术难题尚未被攻克的背景下，开发出桃瞬时转化方法，具有重要研究意义。专利cn113717923a公开了利用山核桃原生质体制备瞬时转化体系的方法，该方法是采用山核桃愈伤组织制备原生质体，然后针对原生质体进行瞬时转化；专利cn112522306a公开了一种弱光处理显著提高桃叶片瞬时转化效率的方法，该方法利用桃叶在弱光处理的条件下进行瞬时转化；现有的瞬时转化方法，多是针对原生质体或愈伤组织的，在其它物种上有针对种子进行瞬时转化的，但是由于桃核种子的结构，并且采用常规的培养方法培养得毛桃种子胚芽的转化率低。造成现在无法利用毛桃种子进行瞬时转化。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提出一种桃实生种子的瞬时转化方法及其应用。

2、本发明的技术方案是这样实现的：

3、一种桃实生种子的瞬时转化方法，步骤如下：

4、（1）将种子从桃核中取出，于水中浸泡，然后去除种子胚根一端1/3的种皮，然后置于湿润的纱布上进行遮光萌发；

5、（2）经步骤（1）处理后的种子去除一片子叶后，浸没于含有重组载体的菌液中，进行真空侵染，然后将种子进行恒温遮光培养，完成桃实生种子的瞬时转化。

6、上述步骤（1）中水中浸泡的时间为24h。

7、上述，遮光萌发的温度为25-29℃，时间为5-7天。

8、上述步骤（2）中经步骤（1）处理后的种子的胚根长度为0.8-1.2cm、胚芽呈现微绿色。

9、上述重组载体指含有gfp基因的重组载体，菌液为农杆菌菌液。

10、上述重组载体指将35s-gfp插入psak277载体获得的重组载体，菌液为根癌农杆菌菌株 gv3101菌液。

11、上述真空侵染的压强为0.09 mpa，时间为25 min，恒温遮光培养的温度为28℃。

12、上述的瞬时转化方法在培育转基因植株中的应用。

13、上述转基因植株指毛桃转基因植株。

14、本发明具有以下有益效果：

15、1、针对现有的桃种子瞬时转化效率低，本发明通过研究发现去掉一片子叶进行瞬时转化的转化效率是去除两片子叶的12.8倍，去除一片子叶可显著提高转化效率（图1），且不影响种子的正常生长。

16、2、与现有桃瞬时转化方法相比，本方法操作简单、植物材料无需无菌操作（现有的转化方法是要求在无菌的条件下进行），利用本申请的方法可高效地将外源gfp基因转入桃胚芽生长点中，且转基因效果能持续9 d，远高于现有的瞬时转化效果维持时间。

技术特征：

1.一种桃实生种子的瞬时转化方法，其特征在于，步骤如下：

2.根据权利要求1所述的桃实生种子的瞬时转化方法，其特征在于：所述步骤（1）中水中浸泡的时间为24h。

3.根据权利要求2所述的桃实生种子的瞬时转化方法，其特征在于：去除种子胚根一端的种皮占种皮的1/3。

4.根据权利要求1-3任一项所述的桃实生种子的瞬时转化方法，其特征在于：遮光萌发的温度为25-29℃，时间为5-7天。

5.根据权利要求4所述的桃实生种子的瞬时转化方法，其特征在于：所述步骤（2）中经步骤（1）处理后的种子的胚根长度为0.8-1.2cm、胚芽呈现微绿色。

6.根据权利要求5所述的桃实生种子的瞬时转化方法，其特征在于：所述重组载体指含有gfp基因的重组载体，菌液为农杆菌菌液。

7. 根据权利要求6所述的桃实生种子的瞬时转化方法，其特征在于：所述重组载体指将35s-gfp插入psak277载体获得的重组载体，菌液为根癌农杆菌菌株 gv3101菌液。

8. 根据权利要求5-7任一项所述的桃实生种子的瞬时转化方法，其特征在于：所述真空侵染的压强为0.09 mpa，时间为25 min，恒温遮光培养的温度为28℃。

9.权利要求1-3、5-7任一项所述的瞬时转化方法在培育转基因植株中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述转基因植株指毛桃转基因植株。

技术总结
本发明属于生物技术领域，涉及一种桃实生种子的瞬时转化方法及其应用。以毛桃实生种子为侵染材料，将种子从桃核中取出，并于25℃清水中浸泡1 d；之后，去除种子胚根一端的种皮，并置于湿润纱布上在25℃、遮光条件下进行种子萌发6 d，去除一片子叶后进行瞬时转化。与现有桃瞬时转化方法相比，本技术通过去除一片子叶后可有效提高转化效率，且转化效果维持时间长，可用于持续的荧光观察。

技术研发人员：程钧,邵允,冯建灿,张郎郎,郑先波,谭彬,王伟
受保护的技术使用者：河南农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13