一种羊肚菌原生质体制备及育种的方法

本发明属于食用菌生产，具体涉及一种羊肚菌原生质体制备及育种的方法。

背景技术：

1、近几年，越来越多的学者将目光投向原生质体育种技术，已见发表的论文就已涉及草菇、香菇、鸡腿菇、秀珍菇、猴头菇、平菇、蟹味菇、金针菇、白灵菇等诸多品种。原生质体育种可帮助降低育种耗时、提高育种效率，近年来常见为原生质体融合、原生质体诱变。如陈小红等以peg为融合剂，成功将灵芝的漆酶基因转入茯苓中，为茯苓菌种同质化严重的困局给出了新思路。刘璐通过紫外线诱变香菇yj-01原生质体，选育出具有遗传稳定、耐高温性良好等优点的香菇新品种。

2、值得注意的是，常常在原生质体育种中作为某一环节的原生质体再生，实际也存在着出现遗传变异、获得新型菌株的可能。原生质体的再生无性系变异，即是指原生质体因为脱离了细胞壁的保护，对环境的感知变得更为敏感，更易受制备、再生条件中的各类物化因素影响而产生变异，使得生成的子代相较于亲本，性状上发生了改变。

3、利用此种方法获取新型食用菌菌种，不仅简单高效，对仪器设备要求低，所需要的药品对身体也都并无伤害，还不会掩盖住多核菌丝食用菌中发生的个别细胞核变异。此外，原生质体再生无性系变异技术还可用于食用菌的遗传和生理生化研究，同别的原生质体育种手段相结合。

4、可惜目前有关羊肚菌的研究并不太多，且多集中在药理研究和食用菌废渣栽培研究等方面。有关羊肚菌育种，尤其是羊肚菌原生质体再生无性系变异育种，更是尚未见报道。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种羊肚菌原生质体制备及育种的方法，该选育方法通过对新育种途径的探索，不仅可帮助节约生产成本、获得更高经济效益，为羊肚菌产业的未来发展起到助力。

2、为了达到上述技术目的，本发明的技术方案是：

3、一种羊肚菌原生质体制备及育种的方法，包括如下步骤：

4、1、镊子灭菌后，将羊肚菌菌盖与菌柄连接处的菌丝体转移至pda固体培养基，25℃下恒温培养箱中倒置培养。用灭菌后的剪刀纵切羊肚菌的菌盖与菌柄连接处，挑取其中的细小菌体，以中心处、与空气接触较远的位置为宜。

5、2、待pda固体培养基中生长出较多菌丝时，无菌操作挑取一小块，接种后进行活化。

6、3、待新生菌丝将覆盖整块培养基时，利用6mm打孔器从菌落边缘打取小菌丝块；将小菌丝块接种至垫有玻璃纸的pda固体培养基，25℃下继续于恒温培养箱中倒置培养，持续5～9d。

7、4、取pda固体培养基培养5～9d的羊肚菌菌丝体，在酶解液浓度为1.0～3.0％，ph值为4.5～6.5，摇床温度为30℃条件下，进行酶解1.5～3.5h。优选的，酶解液浓度为1.5～2.5％，ph值为5.0～6.0，酶解时间为2.5～3.5h。

8、5、用0.5cm厚脱脂棉球过滤酶解完成后的残余菌丝；再用稳渗液重复冲洗脱脂棉球2～3次，所得滤液在离心机中以3000r/min离心10min；移液枪吸取上悬液后弃去，所得沉淀再用稳渗液清洗2～3次。

9、6、移液枪吸取100μl，涂布于再生麦芽糖-蔗糖高渗培养基，继续25℃下培养7～10d。

10、7、待再生麦芽糖-蔗糖高渗培养基中陆续出现了众多白色菌落时，及时将其从培养基上挑出，并接种至新的pda固体培养基，25℃下继续静置培养5～10d。

11、8、采用直径6mm的打孔器对菌株进行打孔，并转接到pda固体培养基与亲本进行拮抗实验，25℃下静置培养，将产生拮抗线的菌株置于新pda固体培养基培养。具体的，每个pda固体培养基除亲本外，放2～3株菌种，25℃下静置培养并持续观察菌丝体生长情况，尤其注意观察有无拮抗现象出现。若有，将产生拮抗线的菌株及时编号并完成记录，随后再分别将其置于新pda固体培养基培养。

12、9、传代培养四次后，用直径6mm的打孔器进行打孔，并接入新的pda固体培养基，25℃下静置培养7～10d，得到羊肚菌再生变异菌种。

13、pda固体培养基配制：去皮土豆200g、琼脂24g、葡萄糖20g、蒸馏水1000ml，ph用1mol/l氢氧化钠调节至7.0～7.2。

14、再生麦芽糖-蔗糖高渗培养基配制：麦芽糖10g、可溶性淀粉10g、葡萄糖4g、磷酸二氢钾1g、酵母浸粉4g、七水合硫酸镁1g、维生素b11g,蔗糖0.6mol、蒸馏水1000ml，ph调节至5.5。

15、稳渗液配制：将109.3g甘露醇，溶于1000ml去离子水中，配制得到0.6mol/l的稳渗液，灭菌备用。

16、酶解液配制：用稳渗液溶解溶壁酶，配制酶浓度(m/v)为1.0～3.0％的酶解液，并用0.22μm微孔滤膜过滤完成灭菌。

17、本发明通过对新育种途径的探索，不仅可帮助节约生产成本、获得更高经济效益，为羊肚菌产业的未来发展起到助力，对其他菌种原生质体育种研究也提供了一定的思路参考，为食用菌细胞水平育种增加了更多可能。

技术特征：

1.一种羊肚菌原生质体制备及育种的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种羊肚菌原生质体制备及育种的方法，其特征在于：酶解液浓度为1.5～2.5％，ph值为5.0～6.0，酶解时间为2.5～3.5h。

3.根据权利要求1所述的一种羊肚菌原生质体制备及育种的方法，其特征在于，pda固体培养基：去皮土豆200g、琼脂24g、葡萄糖20g、蒸馏水1000ml，ph调节为7.0～7.2。

4.根据权利要求1所述的一种羊肚菌原生质体制备及育种的方法，其特征在于，再生麦芽糖-蔗糖高渗培养基：麦芽糖10g、可溶性淀粉10g、葡萄糖4g、磷酸二氢钾1g、酵母浸粉4g、七水合硫酸镁1g、维生素b11g、蔗糖0.6mol、蒸馏水1000ml，ph调节为5.5。

5.根据权利要求1所述的一种羊肚菌原生质体制备及育种的方法，其特征在于：将109.3g甘露醇，溶于1000ml去离子水中，配制得到0.6mol/l的稳渗液，灭菌备用。

6.根据权利要求1所述的一种羊肚菌原生质体制备及育种的方法，其特征在于：用稳渗液溶解溶壁酶，配制酶浓度为1.0～3.0％的酶解液，并用0.22μm微孔滤膜过滤完成灭菌。

技术总结
本发明公开了一种羊肚菌原生质体制备及育种的方法，包括如下步骤：取PDA固体培养基培养5～9d的羊肚菌菌丝体，在酶解液浓度为1.0～3.0％，pH值为4.5～6.5，摇床温度为30℃条件下，进行酶解1.5～3.5h；用厚脱脂棉球过滤酶解完成后的残余菌丝，所得滤液在离心机中以3000r/min离心10min，所得沉淀再用稳渗液清洗；移液枪吸取100μL，涂布于再生麦芽糖‑蔗糖高渗培养基，继续25℃下培养7～10d；待中陆续出现了众多白色菌落时，及时将其接种至新的PDA固体培养基，25℃下继续静置培养5～10d，转接到PDA固体培养基与亲本进行拮抗实验，将产生拮抗线的菌株置于新PDA固体培养基培养。本发明不仅可帮助节约生产成本、获得更高经济效益，为羊肚菌产业的未来发展起到助力。

技术研发人员：宋驰,周欣,曹嘉莹,徐寒雯
受保护的技术使用者：常熟理工学院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13