包含微小RNA识别元件的CMV载体

本发明实施方式涉及cmv载体在免疫中的用途，更具体地，涉及用异源抗原免疫后引发非常规免疫应答的改良cmv载体形式的生成。感谢政府支持本发明是在美国政府的支持下根据美国国立卫生研究院授予的资助号p01ai094417的条款创建的。美国政府对本发明享有一定的权利。

背景技术：

1、表达猿猴免疫缺陷病毒蛋白的恒河猴巨细胞病毒疫苗(rhcmv/siv)提供对致病siv的保护(hansen sg等，nat med 15,293

2、(2009)；hansen sg等，nat 473,523(2011)；这两篇文献均通过引用并入本发明)。这种保护与其他t细胞疫苗根本不同之处在于其非常有效并且几乎瞬时发作，约50％的疫苗在病毒血症严重钝化和收缩急性期后表现出对病毒复制的完全控制。尽管受rhcmv保护的猕猴呈现周期性低水平的病毒血症“脉冲”，但没有观察到cd4+记忆t细胞耗竭，没有出现siv特异性抗体应答，随后，随着时间的推移，病毒核酸变得几乎无法量化而有复制能力的病毒从受保护动物的组织中消失。这些事件在自发siv优良对照和dna初始/ad5加强接种的对照中并未发生(hansen sg等，nature 502,100(2013)；其通过引用并入本发明)。考虑到在rhcmv/

3、siv接种的猕猴中rhcmv诱导的cd8+t细胞在介导这种保护作用中的核心作用，界定这些t细胞的功能特性对理解它们对rhcmv/siv载体诱导控制siv复制的机理贡献至关重要。理解这些特性可能反过来导致表达异源抗原的巨细胞病毒疫苗载体的新用途。

4、cmv可在髓系细胞中潜伏并重新激活，并且巨噬细胞在病毒传播中起核心作用。此外，树突状细胞是必需的体内抗原呈递细胞。表达异源抗原的cmv载体特异性地构建为它们不能在这些细胞中复制，可以用作引发改良的非常规免疫谱的新疫苗候选物。

技术实现思路

1、本发明公开了巨细胞病毒(cmv)载体，其包含编码至少一种异源抗原的第一核酸序列；和包含微小rna识别元件(mre)的第二核酸序列，所述第二核酸序列在由髓系细胞表达的微小rna存在下沉默表达。微小rna识别元件可操作地连接到cmv基因上，该cmv基因是体内cmv生长所必需的或促进体内cmv生长。所述载体还包括编码活性ul128蛋白(或其直系同源物)的核酸序列和编码活性ul130蛋白(或其直系同源物)的核酸序列。在一些实施方式中，所述载体将缺乏活性ul128蛋白和活性ul130蛋白。

2、本发明还公开了在受试者中对至少一种异源抗原产生免疫应答的方法。该方法包括以有效引起对异源抗原的cd8+t细胞应答的量向受试者施用本发明公开类型的cmv载体。该免疫应答的特征在于至少10％的cd8+t细胞受ii类mhc限制，少于10％的细胞受mhc-e限制。

技术特征：

1.一种巨细胞病毒(cmv)载体，其包含：

2.如权利要求1所述的cmv载体，其中在mir-142-3p、mir-223，mir-27a、mir-652、mir-155、mir146a、mir-132、mir-21或mir-125中的一种或一种以上存在下，所述第一mre沉默。

3.如权利要求1或2所述的cmv载体，其中所述至少一种异源抗原包含病原体特异性抗原、肿瘤抗原、组织特异性抗原或宿主自身抗原。

4.如权利要求3所述的cmv载体，其中所述宿主自身抗原是源自t细胞受体(tcr)的可变区的抗原或源自b细胞受体的可变区的抗原。

5.如权利要求3所述的cmv载体，其中所述病原体特异性抗原衍生自选自以下的病原体：人类免疫缺陷病毒、猿猴免疫缺陷病毒、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒、疟原虫寄生虫和结核分枝杆菌。

6.如权利要求3所述的cmv载体，其中所述肿瘤抗原与选自以下的癌症有关：急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、骨髓增生异常综合征、急性淋巴母细胞性白血病、慢性淋巴母细胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、恶性黑素瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌、肾细胞癌(rcc)和生殖细胞肿瘤。

7.如权利要求1-6中任一项所述的cmv载体，其中所述cmv载体不表达活性ul82(pp71)蛋白、us11或其直系同源物。

8.如权利要求1-7中任一项所述的cmv载体，其中所述cmv载体不表达活性ul79蛋白或其直系同源物。

9.如权利要求1-8中任一项所述的cmv载体，其中所述cmv载体不表达活性us11蛋白或其直系同源物。

10.如权利要求1-6中任一项所述的cmv载体，其中所述cmv载体不表达活性ul82(pp71)蛋白或活性ul79蛋白、或其直系同源物。

11.如权利要求1-6中任一项所述的cmv载体，其中所述cmv载体不表达活性ul82(pp71)蛋白或活性us11蛋白、或其直系同源物。

12.如权利要求1-6中任一项所述的cmv载体，其中所述cmv载体不表达活性ul79蛋白或活性us11蛋白质、或其直系同源物。

13.如权利要求1-6中任一项所述的cmv载体，其中所述cmv载体不表达活性ul79蛋白、活性ul82(pp71)蛋白、或活性us11蛋白、或其直系同源物。

14.如权利要求1-13中任一项所述的cmv载体，其中所述cmv载体是人cmv(hcmv)载体或恒河猴cmv(rhcmv)载体。

15.一种在受试者中产生针对至少一种异源抗原的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-14中任一项所述的cmv载体以在所述受试者中引发针对所述至少一种异源抗原的cd8+t细胞应答。

16.如权利要求15所述的方法，其中由所述cmv载体引发的所述cd8+t细胞中的至少10％受ii类mhc或其直系同源物限制。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述cd8+t细胞中的至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％或至少75％受ii类mhc或其直系同源物限制。

18.如权利要求17所述的方法，其中少于10％的所述cd8+t细胞受mhc-e或其直系同源物限制。

19.如权利要求15-18中任一项所述的方法，其中所述受试者先前已经暴露于cmv。

20.如权利要求15-19中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类或非人灵长类动物。

21.如权利要求15-20中任一项所述的方法，其中施用所述cmv载体包括皮下、静脉内、肌内、腹膜内或口服施用所述cmv载体。

22.一种巨细胞病毒(cmv)载体，其包含：

23.如权利要求22所述的cmv载体，其中在mir-142-3p、mir-223，mir-27a、mir-652、mir-155、mir146a、mir-132、mir-21或mir-125中的一种或一种以上存在下，所述第一mre沉默。

24.如权利要求22或23所述的cmv载体，其中所述至少一种异源抗原包含病原体特异性抗原、肿瘤抗原、组织特异性抗原、或宿主自身抗原。

25.如权利要求24所述的cmv载体，其中所述宿主自身抗原是源自t细胞受体(tcr)的可变区的抗原或源自b细胞受体的可变区的抗原。

26.如权利要求24所述的cmv载体，其中所述病原体特异性抗原源自选自以下的病原体：人类免疫缺陷病毒、猿猴免疫缺陷病毒、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒、疟原虫寄生虫和结核分枝杆菌。

27.如权利要求24所述的cmv载体，其中所述肿瘤抗原与选自以下的癌症有关：急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、骨髓增生异常综合征、急性淋巴母细胞性白血病、慢性淋巴母细胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、恶性黑素瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌、肾细胞癌(rcc)和生殖细胞肿瘤。

28.如权利要求22-27中任一项所述的cmv载体，其中所述cmv载体不表达活性ul82(pp71)蛋白、us11、或其直系同源物。

29.如权利要求22-28中任一项所述的cmv载体，其中所述cmv载体不表达活性ul79蛋白或其直系同源物。

30.如权利要求22至29中任一项所述的cmv载体，其中所述cmv载体不表达活性us11蛋白或其直系同源物。

31.如权利要求22-27中任一项所述的cmv载体，其中所述cmv载体不表达活性ul79蛋白或活性ul82(pp71)蛋白、或其直系同源物。

32.如权利要求22-27中任一项所述的cmv载体，其中所述cmv载体不表达活性ul82(pp71)蛋白或活性us11蛋白、或其直系同源物。

33.如权利要求22-27中任一项所述的cmv载体，其中所述cmv载体不表达活性ul79蛋白或活性us11蛋白、或其直系同源物。

34.如权利要求22-27中任一项所述的cmv载体，其中所述cmv载体不表达活性ul79蛋白、活性ul82(pp71)蛋白、或活性us11蛋白、或其直系同源物。

35.如权利要求22-34中任一项所述的cmv载体，其中所述cmv载体是人cmv(hcmv)载体或恒河猴cmv(rhcmv)载体。

36.一种在受试者中产生针对至少一种异源抗原的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求22-35中任一项所述的cmv载体，以在所述受试者中引发针对所述至少一种异源抗原的cd8+t细胞应答。

37.如权利要求36所述的方法，其中由所述cmv载体引发的cd8+t细胞中的至少10％受ii类mhc或其直系同源物限制。

38.如权利要求37所述的方法，其中所述cd8+t细胞中的至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％或至少75％受ii类mhc或其直系同源物限制。

39.如权利要求38所述的方法，其中受mhc-ii限制的cd8+t细胞识别“超表位”，即由多个不同的mhc-ii等位基因呈递的肽。

40.如权利要求38所述的方法，其中少于10％的所述cd8+t细胞受mhc-i或其直系同源物限制。

41.如权利要求36-40中任一项所述的方法，其中所述受试者先前已经暴露于cmv。

42.如权利要求36-41中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类或非人灵长类动物。

43.如权利要求36-42中任一项所述的方法，其中施用所述cmv载体包括皮下、静脉内、肌内、腹膜内或口服施用所述cmv载体。

技术总结
本发明公开了包含异源抗原和微小RNA识别元件的重组CMV载体，以在源自髓样细胞的微小RNA，活性UL128蛋白和活性UL130蛋白存在下沉默CMV基因的表达。本发明还公开了包含异源抗原和微小RNA识别元件的重组CMV载体，以在源自髓样细胞的微小RNA，无活性UL128蛋白和无活性UL130蛋白存在下沉默CMV基因的表达。本发明还公开了使用这些载体产生非常规免疫应答的方法。这种免疫应答的特征在于产生主要受MHC‑II限制的CD8+T细胞应答。

技术研发人员：杰伊·内尔松,斯科特·汉森,米根·H·汉考克,路易斯·皮克尔,克劳斯·弗鲁赫
受保护的技术使用者：俄勒冈健康与科学大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15