一种含有异天冬氨酸修饰蛋白的构建方法

本发明属于生物，具体涉及一种含有异天冬氨酸修饰蛋白的构建方法。

背景技术：

1、一般来说，蛋白质由20种l型α氨基酸按照特定的序列通过肽键连接而成。蛋白质在核糖体完成生物合成后，其蛋白质侧链经常会发生各种蛋白质翻译后修饰(ptm)，极大地增加了细胞内蛋白质组的结构和功能多样性，影响蛋白质的稳定性、生物活性、蛋白质间相互作用以及细胞定位等。其中，异天冬氨酸(isod)的形成是一种普遍存在的翻译后修饰，由自发的asn脱酰胺或asp异构化经琥珀酰亚胺中间体(suc)而形成。isod的形成将亚甲基插入蛋白质骨架，产生“扭结”，并可能极大地改变蛋白质的结构和功能，从而在无数生物学过程发挥关键作用。在大多数情况下，isod的形成被认为是蛋白质损伤；另一方面，它也可能在信号传递和调节中发挥作用。但由于其形成速率较慢，获得isod特异性位点修饰的蛋白困难，这一领域的研究受到严重阻碍。

2、目前构建isod蛋白的主要方法是通过asn或asp自发的脱酰胺或脱水，但该反应速率很大程度取决于asn/asp的c侧相邻氨基酸残基以及asn/asp所处位点的蛋白柔顺性，通常在生理条件下其半衰期在1到1000天之间，甚至更长。另外，科学家还通过全合成、表达蛋白连接及羧酸活化等方法获得含有isod修饰的蛋白，但都存在明显的局限性。

3、遗传密码子扩展技术(gce)可以将带有不同结构和功能的非天然氨基酸(ncaa)引入目标蛋白，作为生物物理探针、光交联剂、ptm和药物偶联物对蛋白质进行修饰，在生物学研究和医学应用方面发挥重要作用。蛋白质l-异天冬氨酸甲基转移酶(pimt)能够通过甲基化isod侧链促使suc中间体重新形成，进而部分水解转化为asp。

4、目前，尚未有基于gce获得含有isod修饰蛋白的构建方法。

技术实现思路

1、本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种含有异天冬氨酸修饰蛋白的构建方法。

2、本发明的技术方案概述如下：

3、含有异天冬氨酸修饰蛋白的构建方法，包括如下步骤：

4、(1)将含有氨酰trna合成酶变体库pbk-mbpylrs-nnk5和prep-pylt(gfpuv)质粒的感受态细胞置于液体培养基中，复苏后将其涂布于含有卡那霉素、四环素、氯霉素和酯化天冬氨酸的固体培养基上；待所述培养基晾干后倒置培养；收取生长的细胞，提取dna；

5、所述氨酰trna合成酶变体库pbk-mbpylrs-nnk5的核苷酸序列如seq id no.1所示；

6、所述prep-pylt(gfpuv)质粒的核苷酸序列如seq id no.2所示；

7、(2)将步骤(1)获得的dna电转至含有pneg-pylt-barnase(2tag)质粒的感受态细胞中，复苏后将其涂布于含有卡那霉素、氨苄青霉素和阿拉伯糖的固体培养基上；待所述培养基晾干后倒置培养，收取板上生长的细胞，提取dna；

8、所述pneg-pylt-barnase(2tag)质粒的核苷酸序列如seq id no.3所示；

9、(3)将步骤(2)获得的dna电转至含有prep-pylt(gfpuv)质粒的感受态细胞，复苏后涂布于含有卡那霉素、四环素、氯霉素和酯化天冬氨酸的固体培养基；待所述培养基晾干后倒置培养；

10、(4)挑取步骤(3)倒置培养得到的单克隆至含有卡那霉素和四环素的液体培养基中孵育至饱和；对饱和菌液稀释后，分别涂于两种固体培养基上；其一种是含有卡那霉素、四环素、氯霉素和酯化天冬氨酸的固体培养基，为实验组；另一种是含有卡那霉素、四环素和氯霉素的固体培养基为对照组；待各自的培养基晾干后倒置培养；通过对照实验，将实验组的固体培养基上有明显生长优势而对照组对应位置未长菌的实验组的单克隆挑至含有卡那霉素的液体培养基中，孵育至饱和后提取质粒；

11、(5)对步骤(4)获得的质粒测序，获得能够识别酯化天冬氨酸的氨酰trna合成酶变体，基于遗传密码子扩展技术，得到含有酯化天冬氨酸位点修饰的蛋白；

12、(6)将步骤(5)获得的含有酯化天冬氨酸位点修饰的蛋白在缓冲液1中孵育，获得含有琥珀酰亚胺位点特异性修饰的蛋白；

13、(7)将步骤(6)获得的含有琥珀酰亚胺位点特异性修饰的蛋白在缓冲液2中孵育，获得含有异天冬氨酸修饰的蛋白。

14、所述蛋白为泛素、绿色荧光蛋白或sumo-sfgfp融合蛋白，还可以是其它蛋白。

15、缓冲液1优选ph＝5.0-8.0的磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液。

16、缓冲液2优选ph＝7.4-11.0的磷酸盐缓冲液。

17、本发明具有以下优点：

18、(1)本发明成功在蛋白质特定位点快速构建isod。

19、(2)本发明可极大地缩短制备isod修饰蛋白的时间，不受蛋白氨基酸序列的限制。

20、(3)本发明可与噬菌体展示方法相结合，用于isod多肽药物的研发。

技术特征：

1.含有异天冬氨酸修饰蛋白的构建方法，其特征是包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述蛋白为泛素、绿色荧光蛋白或sumo-sfgfp融合蛋白。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述缓冲液1为ph＝5.0-8.0的磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液。

4.根据权利要求1或所述的方法，其特征是所述缓冲液2为ph＝7.4-11.0的磷酸盐缓冲液。

技术总结
本发明公开了一种含有异天冬氨酸修饰蛋白的构建方法，通过对氨酰tRNA合成酶变体库的筛选获得能够识别酯化天冬氨酸的氨酰tRNA合成酶变体，基于遗传密码子扩展技术，将酯化天冬氨酸编码至目的蛋白，在中性或弱碱性条件下孵育，酯化天冬氨酸位点首先转化为琥珀酰亚胺中间体，然后在碱性条件下相对快速地水解获得含有异天冬氨酸修饰的蛋白。本发明成功地在蛋白质特定位点快速构建异天冬氨酸修饰，极大地缩短制备异天冬氨酸修饰蛋白的时间，不受蛋白氨基酸序列的限制，并可与噬菌体展示方法相结合，用于含有异天冬氨酸多肽药物的研发。

技术研发人员：轩维民,吴启凡
受保护的技术使用者：天津大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13