一种甘薯曲叶病毒侵染性克隆的构建方法及甘薯高效简易的侵染方法

本发明涉及基因工程以及植物病毒学领域，具体涉及一种甘薯曲叶病毒侵染性克隆的构建方法及甘薯高效简易的侵染方法。

背景技术：

1、甘薯兼具粮食和经济作物的功能，用途广泛，具有非常重要的经济价值。我国是世界上最大的甘薯生产国。近些年来，甘薯的病虫害，特别是病毒病害的发生日益严重。甘薯属无性繁殖作物，世代繁殖很容易感染病毒。其中，甘薯曲叶病毒(sweet potato leafcurl viru s，splcv)是最主要的甘薯dna病毒。要研究病毒与宿主之间的相互作用，首要条件是在实验室条件下，获得高效、稳定、可重复的接种方法。传统的嫁接接种法难以控制侵染单一病毒，病症容易受多种因素影响，稳定性和可重复性差。甘薯曲叶病毒(splcv)是单链dna病毒，属于双生病毒科(geminiviridae)，菜豆金黄花叶病毒属(begomovirus)。目前多数双生病毒侵染性克隆是将1.2–2.0个病毒基因组串联重复连接到农杆菌双元载体，然后利用农杆菌介导的叶片渗透或者茎注射法进行病毒接种。尽管如此，splcv与甘薯之间互作关系的研究还基本处于空白阶段，主要原因是splcv侵染性克隆构建不完善，接种方法不成熟，目前已报道的接种方法效率最高只能达到20％左右。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种甘薯曲叶病毒侵染性克隆的构建方法及甘薯高效简易的侵染方法。

2、本发明的甘薯曲叶病毒侵染性克隆的构建方法，其是将1.01个重复的甘薯曲叶病毒(splcv)基因组序列插入到双元载体中，得到甘薯曲叶病毒侵染性克隆。

3、优选，是将1.01个重复的甘薯曲叶病毒(splcv)基因组序列插入到农杆菌转化的双元载体pcambia1300的多克隆位点中，制备得到pcambia1300-splcv-1.01侵染性克隆。

4、优选，所述的1.01个重复的甘薯曲叶病毒是在甘薯曲叶病毒的基因组序列的末端重复一个病毒复制相关的关键序列茎环结构。

5、优选，是在甘薯曲叶病毒广州株病毒(splcv-gz02)基因的末端重复一个病毒复制相关的关键序列茎环结构，并通过kpni和xbai双酶切位点，连接到农杆菌转化的双元载体pcambia1300中，获得pcambia1300-splcv-1.01侵染性克隆，所述的甘薯曲叶病毒广州株病毒的genbank登录号为jx286654。

6、优选，所述的茎环结构的核苷酸序列为aaggcgggcaccgtattaatattaccggtgcccgccgcgcc，其为41bp。

7、本发明还提供了一种高效简易的利用甘薯曲叶病毒侵染性克隆侵染甘薯的方法，将甘薯曲叶病毒侵染性克隆导入农杆菌agl1菌株中，获得含有甘薯曲叶病毒侵染性克隆的重组农杆菌；将6–8叶时期的甘薯苗浸泡于含有甘薯曲叶病毒侵染性克隆的重组农杆菌菌液中，转移到清水中继续浸泡，然后在移栽基质中培养。

8、所述的甘薯曲叶病毒侵染性克隆是pcambia1300-splcv-1.01侵染性克隆。

9、优选，所述的将6–8叶时期的甘薯苗浸泡于含有甘薯曲叶病毒侵染性克隆的重组农杆菌菌液中是将6–8叶时期，长度15cm的甘薯苗浸泡于含有甘薯曲叶病毒侵染性克隆的重组农杆菌菌液6小时后，转移到清水中继续浸泡12小时。

10、优选，在移栽基质中培养是甘薯苗剪去多余叶片，只保留2–3片，移栽到营养土∶珍珠岩∶沙子体积比例为3∶1∶1混合的基质中继续培养。

11、优选，所述的将6–8叶时期的甘薯苗浸泡于含有甘薯曲叶病毒侵染性克隆的重组农杆菌菌液中，甘薯苗在浸泡前用小刀将甘薯苗的藤蔓切出45度的新鲜切面。

12、优选，所述的含有甘薯曲叶病毒侵染性克隆的重组农杆菌菌液，其菌液浓度为od600＝1.0。

13、优选，所述的含有甘薯曲叶病毒侵染性克隆的重组农杆菌菌液是含有甘薯曲叶病毒侵染性克隆的重组农杆菌用相应抗性的lb培养基过夜培养后，农杆菌重悬于完全诱导培养基中，过夜培养后，农杆菌再重悬于1/4ms浸泡缓冲液中，用于浸泡接种甘薯苗。

14、本发明是将甘薯曲叶病毒(sweet potato leaf curl virus,splcv)基因组中的茎环结构序列在末端重复一次，构建到pcambia1300载体中，制备得到一种最小单元且高效的甘薯曲叶病毒的侵染性克隆。将该侵染性克隆通过农杆菌agl1介导的高效简易的农杆菌浸泡接种法，可以成功侵染甘薯不同品种。本发明提供了一种解决甘薯曲叶病毒接种天然宿主甘薯侵染率低的方法。通过发病症状的观察和pcr的检测，本发明成功将甘薯曲叶病毒的对不同品种甘薯接种率均提高到了100％。不仅如此，本发明所提供的方法不仅高效，而且操作简易，可以实现大规模的接种及筛选，能为后续筛选抗性品种及甘薯曲叶病毒与甘薯相互作用的研究提供技术上的有力支持。

技术特征：

1.一种甘薯曲叶病毒侵染性克隆的构建方法，其特征在于，是将1.01个重复的甘薯曲叶病毒基因组序列插入到双元载体中，得到甘薯曲叶病毒侵染性克隆。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的1.01个重复的甘薯曲叶病毒是在甘薯曲叶病毒的基因组序列的末端重复一个病毒复制相关的关键序列茎环结构。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，是将1.01个重复的甘薯曲叶病毒基因组序列插入到农杆菌转化的双元载体pcambia1300的多克隆位点中，制备得到pcambia1300-splcv-1.01侵染性克隆。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，是在甘薯曲叶病毒广州株病毒基因的末端重复一个病毒复制相关的关键序列茎环结构，并通过kpni和xbai双酶切位点，连接到农杆菌转化的双元载体pcambia1300中，获得pcambia1300-splcv-1.01侵染性克隆，所述的甘薯曲叶病毒广州株病毒的genbank登录号为jx286654。

5.根据权利要求1、2、3或4所述的构建方法，其特征在于，所述的茎环结构的核苷酸序列为aaggcgggcaccgtattaatattaccggtgcccgccgcgcc，其为41bp。

6.一种高效简易的利用甘薯曲叶病毒侵染性克隆侵染甘薯的方法，将权利要求1-5任一甘薯曲叶病毒侵染性克隆导入农杆菌agl1菌株中，获得含有甘薯曲叶病毒侵染性克隆的重组农杆菌；将6–8叶时期的甘薯苗浸泡于含有甘薯曲叶病毒侵染性克隆的重组农杆菌菌液中，转移到清水中继续浸泡，然后在移栽基质中培养。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的甘薯曲叶病毒侵染性克隆是pcambia1300-splcv-1.01侵染性克隆。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的将6–8叶时期的甘薯苗浸泡于含有甘薯曲叶病毒侵染性克隆的重组农杆菌菌液中是将6–8叶时期，长度15cm的甘薯苗浸泡于含有甘薯曲叶病毒侵染性克隆的重组农杆菌菌液6小时后，转移到清水中继续浸泡12小时。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在移栽基质中培养是甘薯苗剪去多余叶片，只保留2–3片，移栽到营养土∶珍珠岩∶沙子体积比例为3∶1∶1混合的基质中继续培养。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的含有甘薯曲叶病毒侵染性克隆的重组农杆菌菌液是含有甘薯曲叶病毒侵染性克隆的重组农杆菌用相应抗性的lb培养基过夜培养后，农杆菌重悬于完全诱导培养基中，过夜培养后，农杆菌再重悬于1/4ms浸泡缓冲液中，用于浸泡接种甘薯苗。

技术总结
本发明公开了一种甘薯曲叶病毒侵染性克隆的构建方法及甘薯高效简易的侵染方法。是将1.01个重复的甘薯曲叶病毒基因组序列插入到双元载体中，得到甘薯曲叶病毒侵染性克隆。本发明提供了一种解决甘薯曲叶病毒接种天然宿主甘薯侵染率低的方法。通过发病症状的观察和PCR的检测，本发明成功将甘薯曲叶病毒的对不同品种甘薯接种率均提高到了100％。另外，本发明所提供的方法不仅高效，而且操作简易，可以实现大规模的接种及筛选，能为后续筛选抗性品种及甘薯曲叶病毒与甘薯相互作用的研究提供技术上的有力支持。

技术研发人员：邓书林,张艺,杨选钢,吕善武
受保护的技术使用者：中国科学院华南植物园
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13