重组大肠杆菌及其构建方法和生产2′-岩藻糖基乳糖的方法与流程

本发明涉及微生物领域，具体涉及一种重组大肠杆菌、一种大肠杆菌的构建方法、所述方法构建得到的重组大肠杆菌、所述重组大肠杆菌在生产2′-岩藻糖基乳糖及其衍生品中的应用、以及一种生产2′-岩藻糖基乳糖的方法。

背景技术：

1、人乳寡糖(human milk oligosaccharides，hmos)是一种复合低聚糖，在母乳中以游离形式存在，是母乳中第三大固体成分，具有显著的生物活性，能够有效地提升母乳的营养价值，其中，2′-岩藻糖基乳糖(2′-fucosyllactose，2′-fl)作为母乳中分泌最丰富的人乳寡糖，约占总hmos的30％。

2、目前商业化2′-岩藻糖基乳糖(2′-fl)的生产主要包括化学法合成、酶催化法合成和微生物发酵法三种方式。化学合成法在生产效率和产品纯度上都表现出色，但是它的生产流程繁复，反应条件苛刻，产物收率偏低，l-岩藻糖价格不菲，并且经常需要使用有毒有害的试剂，这些都限制了它的广泛应用。酶合成法具有反应条件温和、反应成分相对简单以及易于纯化等优点，但酶法存在底物成本高以及产物的得率不高等问题，目前尚处于实验室规模。近年来，利用系统生物学、代谢工程和途径工程等技术手段构建微生物基因工程菌生产2′-岩藻糖基乳糖的研究持续受到关注。相比于化学法和酶法，微生物法具有更快的增殖速度，更容易扩大培养，而且能够使用低成本碳源。因此，它已经成为2′-fl绿色合成的首选方式。

3、目前研究较多的是以大肠杆菌作为底盘细胞，其具有代谢产出鸟嘌呤5'-二磷酸-β-l-岩藻糖(5'-diphospho-β-l-fucose，gdp-l-fucose)的2条完整通路(从头合成途径和补救途径)，通过构建代谢合成途径中的关键酶基因，以重组质粒方式进行过量表达，表达外源α-1,2-岩藻糖基转移酶，发酵生产2'-fl。

4、利用微生物代谢途径合成2′-岩藻糖基乳糖的研究集中于合成途径的构建、代谢竞争途径的基因敲除等方面。li等将2′-fl分为gdp-l-岩藻糖合成模块、乳糖岩藻糖基化模块、辅因子再生模块，通过不同的质粒组合来平衡合成途径，获得了22.3g/l的2′-fl。采用模块化代谢工程策略，将合成途径划分为多个模块，对每个模块进行精细的调控，可以有效地解决代谢流平衡问题。现有技术受限于gdp-l-岩藻糖的胞内合成路径产量过低，导致岩藻糖基化人乳寡糖的产量过低，达不到工业化生产的需求。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种生产2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌，该菌株的2′-岩藻糖基乳糖生产水平有显著提高，本发明还提供了重组大肠杆菌的构建方法以及生产2′-岩藻糖基乳糖的方法，采用本发明所述的重组大肠杆菌生产2′-岩藻糖基乳糖能够在培养90h后生产40.05g/l的2′-fl。

2、为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌含有过表达的甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶基因manc、磷酸甘露糖变位酶基因manb、gdp-甘露糖-6-脱氢酶基因gmd、gdp-岩藻糖合成酶基因wcag和α-1,2岩藻糖基转移酶基因futc；

3、所述重组大肠杆菌中还敲除了udp-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaj、lon蛋白酶基因lon、β-半乳糖苷酶基因lacz和乙醛酸操纵子阻遏蛋白基因iclr。

4、优选地，所述重组大肠杆菌的宿主为大肠杆菌bl21(de3)。

5、优选地，所述重组大肠杆菌中还敲除了d-果糖-6-磷酸醛缩酶b基因fsab、gdp-甘露糖甘露糖基水解酶nudd和d-乳酸脱氢酶基因ldha中的至少一种。

6、本发明第二方面提供一种重组大肠杆菌的构建方法，该方法包括：以大肠杆菌为宿主，向其中导入过表达甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶基因manc、磷酸甘露糖变位酶基因manb、gdp-甘露糖-6-脱氢酶基因gmd、gdp-岩藻糖合成酶基因wcag和α-1,2岩藻糖基转移酶基因futc的质粒，并敲除所述宿主中的udp-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaj、lon蛋白酶基因lon、β-半乳糖苷酶基因lacz和乙醛酸操纵子阻遏蛋白基因iclr，构建得到所述重组大肠杆菌。

7、本发明第三方面提供如上所述的方法构建得到的重组大肠杆菌。

8、本发明第四方面提供如上所述的重组大肠杆菌在生产2′-岩藻糖基乳糖及其衍生品中的应用。

9、本发明第五方面提供一种生产2′-岩藻糖基乳糖的方法，该方法包括：利用如上所述的重组大肠杆菌进行培养和诱导发酵生产2′-岩藻糖基乳糖；

10、其中，所述诱导发酵在碳源、底物和诱导剂的存在下进行。

11、本发明通过在大肠杆菌中外源表达futc，组合调控manc、manb、gmd、wcag等酶的相关基因的过表达，并敲除大肠杆菌宿主2′-岩藻糖基乳糖合成途径中的wcaj基因、lon基因、lacz基因、iclr基因以及优选条件下还可以敲除的fsab基因、nudd基因、ldha基因，并优选通过优化通路配置、rbs强度以及融合标签等方式调节基因表达水平，从而达到提高2′-岩藻糖基乳糖产量的目的。

12、采用本发明的代谢工程菌进行5l罐的岩藻糖基化乳糖的发酵生产验证，结果显示，以甘油为底物时，2′-岩藻糖基乳糖(2′-fl)的生产产量可达40.05g/l。

技术特征：

1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌含有过表达的甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶基因manc、磷酸甘露糖变位酶基因manb、gdp-甘露糖-6-脱氢酶基因gmd、gdp-岩藻糖合成酶基因wcag和α-1,2岩藻糖基转移酶基因futc；

2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其中，所述重组大肠杆菌的宿主为大肠杆菌bl21(de3)；和/或

3.根据权利要求1或2所述的重组大肠杆菌，其中，所述过表达是基因在松弛型质粒载体上表达；

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的重组大肠杆菌，其中，manc基因、manb基因、gmd基因和wcag基因各自独立地来源于大肠杆菌escherichia coli，优选各自独立地来自于大肠杆菌k-12，更优选地，其核苷酸序列依次如seq id no.1-4所示；和/或

5.一种重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，该方法包括：以大肠杆菌为宿主，向其中导入过表达甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶基因manc、磷酸甘露糖变位酶基因manb、gdp-甘露糖-6-脱氢酶基因gmd、gdp-岩藻糖合成酶基因wcag和α-1,2岩藻糖基转移酶基因futc的质粒，并敲除所述宿主中的udp-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaj、lon蛋白酶基因lon、β-半乳糖苷酶基因lacz和乙醛酸操纵子阻遏蛋白基因iclr，构建得到所述重组大肠杆菌；

6.根据权利要求5所述的方法，其中，通过ptargetf载体进行基因的敲除；和/或

7.根据权利要求5或6所述的方法，其中，manc基因、manb基因、gmd基因和wcag基因各自独立地来源于大肠杆菌escherichia coli，优选各自独立地来自于大肠杆菌k-12，更优选地，其核苷酸序列依次如seq id no.1-4所示；和/或

8.权利要求5-7中任意一项所述的方法构建得到的重组大肠杆菌。

9.权利要求1-4和8中任意一项所述的重组大肠杆菌在生产2′-岩藻糖基乳糖及其衍生品中的应用。

10.一种生产2′-岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于，该方法包括：利用权利要求1-4或8中任意一项所述的重组大肠杆菌进行培养和诱导发酵生产2′-岩藻糖基乳糖；

技术总结
本发明涉及微生物领域，公开了重组大肠杆菌及其构建方法和生产2′‑岩藻糖基乳糖的方法，所述重组大肠杆菌含有过表达的甘露糖‑1‑磷酸鸟嘌呤基转移酶基因manC、磷酸甘露糖变位酶基因manB、GDP‑甘露糖‑6‑脱氢酶基因gmd、GDP‑岩藻糖合成酶基因wcaG和α‑1,2岩藻糖基转移酶基因futC；所述重组大肠杆菌中还敲除了UDP‑葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaJ、Lon蛋白酶基因lon、β‑半乳糖苷酶基因lacZ、乙醛酸操纵子阻遏蛋白基因iclR。采用所述重组大肠杆菌生产2′‑FL能够取得较高的产量，以甘油为底物时，2′‑FL的产量可达40.05g/L。

技术研发人员：李邓斌,魏超,张媛,王小艳,张根林,王靖,李萱,王格格,孙浩轩,赵国淼,周娜娜
受保护的技术使用者：中粮营养健康研究院有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14