一种植物CGBE碱基编辑系统及其应用

本发明涉及生物技术和植物基因工程。具体而言，本发明涉及一种新型的cgbe碱基编辑器在水稻基因打靶方面的应用，可以提高水稻中的c到g的碱基编辑效率。

背景技术：

1、导致人类遗传病的遗传变异中绝大多数是点突变，因此开发可诱导精准点突变的单碱基编辑工具有极为重要的意义。基因组编辑技术，特别是基于crispr/cas9系统的基因组编辑技术可以通过同源重组(hr)介导的dna修复途径来实现在基因组位点中引入特定碱基的替换。crispr引导的dna胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑器已经被广泛应用于基因组编辑上，基于crispr系统的基因组编辑技术可以通过同源重组(hr)介导的dna修复途径来实现在基因组位点中引入特定碱基的替换单碱基编辑工具中，目前基于crispr的碱基编辑器包括胞嘧啶碱基编辑器(cytosine base editor,cbe)和腺嘌呤碱基编辑器(adenine baseeditor,abe)，已被广泛应用于生命科学的各个领域，而且这两类工具的系统性优化和改造已经取得诸多成果，并已被用于多种遗传病的治疗研究。但是，目前这两种碱基编辑器只能产生嘌呤到嘌呤、嘧啶到嘧啶的转换，并不能产生嘌呤到嘧啶的互换。

2、已经有文献报道了一种糖基化酶碱基编辑器cgbe，它能够在哺乳动物细胞和部分植物中进行c-g编辑。已有团队利用这个编辑器在哺乳动物细胞中的某些基因上实现了>90％的精度(平均96％)和高达70％的效率(平均14％)的编辑，而在植物细胞中在目前的报道中编辑效率只有不到30％，与动物中的编辑效率以及精度都相差甚远。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供一种能够实现植物中高效的c到g的碱基转化的cgbe碱基编辑工具。

2、本发明提供一种植物cgbe碱基编辑系统，其中，所述植物cgbe碱基编辑系统包括第一表达盒和第二表达盒；

3、其中，所述的第一表达盒为向导rna表达盒，具有式ii结构：p1-a-b-t(i)；其中，

4、(a)p1为第1启动子；

5、(b)a为无或目标位点引导序列sg；

6、(c)b为sgrna支架结构序列；

7、(d)t为终止序列。

8、优选地，所述第二表达盒为yung-gbe融合蛋白表达盒，所述yung-gbe融合蛋白具有式ii结构：p2-c-d-e-f-g-h-i-j(ii)；其中，

9、(a)p2为第2启动子；

10、(b)c为无或核定位信号序列nls；

11、(c)d为apo1-r33a基因序列；

12、(d)e为任意的连接肽或连接序列；

13、(e)f为nspcas9的基因序列；

14、(f)g为任意的连接肽或连接序列；

15、(g)h为所述yung的基因序列；

16、(h)i为无或核定位信号序列nls；

17、(i)j为终止子，

18、其中，c和h至多一个为无。

19、本发明还提供一种植物胞cgbe基编辑系统，所述的yung-gbe融合蛋白表达盒和向导rna表达盒位于同一表达载体上。

20、本发明还提供一种cgbe碱基编辑载体，所述cgbe碱基编辑载体包括第一表达盒和第二表达盒，或者所述cgbe碱基编辑载体为编辑载体对，所述编辑载体对分别包括第一表达盒和第二表达盒，第一表达盒为序列表中seq id no:2所示序列，第二表达盒为序列表中seq id no:1所示序列。

21、本发明还提供一种所述的cgbe碱基编辑系统的应用，所述应用包括：利用所述的cgbe碱基编辑载体，实现对水稻基因组的碱基编辑，从而获得含有碱基突变的转基因植物或植物部分。

22、另一方面，本发明还提供一种将所述的基因组编辑载体基因导入水稻细胞的方法。

23、本发明还提供一种转基因细胞，所述转基因细胞转入有如上所述的表达盒或如上所述的编辑载体。

24、seq id no:1如下，与随附的序列表电子版相同

25、

26、

27、

28、本发明所提供的一种基于yung-gbe系统的碱基编辑载体及其应用，可以应用于对水稻或其他单子叶植物的基因组进行编辑，以水稻基因组上片段为靶标，能够在pam序列下游的第5-7位的碱基进行突变，实现c to g的碱基精准替换。

技术特征：

1.一种植物cgbe碱基编辑系统，其特征在于，所述植物cgbe碱基编辑系统包括第一表达盒和第二表达盒；

2.根据权利要求1所述的植物cgbe碱基编辑系统，其特征在于，所述第一表达盒由序列表中seq id no:2所示的核苷酸序列构成。

3.根据权利要求1所述的植物cgbe碱基编辑系统，其特征在于，所述第二表达盒为yung-gbe融合蛋白表达盒，所述yung-gbe融合蛋白具有式ii结构：p2-c-d-e-f-g-h-i-j(ii)；其中，

4.根据权利要求3所述的植物cgbe碱基编辑系统，所述的yung-gbe的dna切割活性缺失，由序列表中seq id no:1所示的核苷酸序列构成。

5.根据权利要求3所述的植物胞嘧啶碱基编辑系统，其特征在于，所述的第一表达盒和第二表达盒位于同一表达载体上。

6.根据权利要求3所述的植物cgbe碱基编辑系统，其特征在于，所述的第一表达盒和第二表达盒分别连接在不同表达载体上，两个表达载体置于同一遗传转化系统中。

7.一种cgbe碱基编辑载体，所述cgbe碱基编辑载体包括第一表达盒和第二表达盒，或者所述cgbe碱基编辑载体为编辑载体对，所述编辑载体对分别包括第一表达盒和第二表达盒，第一表达盒为序列表中seq id no:2所示序列，第二表达盒为序列表中seq id no:1所示序列。

8.一种权利要求1-4中任意一项所述的植物cgbe碱基编辑系统的应用，其特征在于，所述应用包括：利用所述植物cgbe碱基编辑系统，对水稻基因组中预定位置的c碱基进行碱基编辑，使其突变至g碱基，从而获得含有碱基突变的转基因植物或植物部分。

9.一种将权利要求1中所述的植物cgbe碱基编辑系统导入水稻细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：

技术总结
一种植物CGBE碱基编辑系统及其应用，涉及基因学领域。所述植物CGBE碱基编辑系统，在失活的Cas9蛋白基因nSpCas9的基础上，加上来自酵母的尿嘧啶糖基化酶基因yUNG，融合大鼠来源的胞嘧啶脱氨酶基因rAPO的突变体APO1‑R33A，以有效地诱导目标C到G碱基转换，减少不必要的C到W(W＝A或T)和indel突变水平。利用本发明的基因编辑系统，可以识别PAM序列为NGG的靶点序列，在预定的植物基因组位点的编辑窗口内产生单个C到G的替换，为植物基因组中实施准确的碱基编辑提供了新的方法和思路。

技术研发人员：魏鹏程,余操,吴潇雅,刘小双,周苏淮,蒋迎利,王欢欢
受保护的技术使用者：安徽农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13