一种提高新冠全长S蛋白mRNA完整性的制备方法及用途与流程

本发明涉及生物制药领域，具体地涉及一种提高新冠全长s蛋白mrna完整性的制备方法及用途。

背景技术：

1、mrna疫苗在covid-19大流行期间成为人们关注的焦点，是许多公司用于开发疫苗的最前沿技术。在1990年首次发现，将编码的mrna注射到小鼠骨骼肌中后观察到蛋白质的表达。这些早期实验证明，体外转录的mrna可以诱导活组织中蛋白质的产生。

2、mrna技术具有几个优点，使其成为传统型疫苗甚至dna疫苗的升级替代品。与减毒或灭活疫苗不同，mrna只表达特定的目的抗原并诱导有效的免疫反应。因为表达不需要进入核内，没有随机基因组整合的风险，所以与dna疫苗相比，mrna疫苗更安全。mrna疫苗平台的灵活性有利于大规模制造，同时也利于生产的标准化。此外，由于mrna的生产基于体外无细胞转录反应，因此可以最大限度避免其他平台中常见的细胞源性杂质和病毒成分等安全性问题。

3、近几年，作为疫情以来的热门技术，mrna备受各大药企关注，越来越多的制药公司开始布局mrna平台的研发，行业进入到加速发展期。截至目前，已经有两款mrna疫苗产品上市。随着美国药典(usp)发布的“analytical procedures for mrna vaccine quality”指南草案、国家药监局药审中心发布的《新型冠状病毒预防用mrna疫苗药学研究技术指导原则(试行)》等5个指导原则，都彰显了监管机构对于mrna技术的重视，同时也更加规范了mrna技术行业。

4、在mrna疫苗的研发及生产过程中，涉及对mrna原料药特性、纯度、浓度、物理状态(包括外观、ph值、完整性等)和安全性等多方面的质量评估，其中对mrna完整性的评估至关重要。

5、中国国家药品监督管理局药品审评中心发布的《新型冠状病毒预防用mrna疫苗药学研究技术指导原则(试行)》中指出“应选用可充分鉴别产品相关杂质(截短mrna、长rna、双链rna等)且具有足够灵敏度的检测方法对原液、制剂等不同阶段mrna序列的完整性和纯度予以确认和控制，如毛细管电泳等。”；美国药典关于“analytical procedures for mrnavaccine quality”的指导草案中，也推荐使用毛细管凝胶电泳对mrna完整性进行质控，其中推荐了agilent system并详述了其实验方法。

6、考虑到mrna的完整性会影响抗原蛋白的表达，需要开发一种可以有效提升新冠全长s蛋白mrna完整性的制备方法。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的至少部分问题，如mrna本身稳定性差的特性，体外转录制备过程中易降解，导致完整性降低，尤其对于长片段的mrna更为显著的问题，本发明提供一种提高新冠全长s蛋白mrna完整性的制备方法及用途。具体地，本发明包括以下内容。

2、本发明的第一方面，提供一种提高新冠全长s蛋白mrna完整性的制备方法，其包括以下步骤：

3、(1)制备质粒线性化模板，其中，所述质粒包含来源于新冠全长s蛋白基因；

4、(2)配制转录体系，进行体外转录，其中所述转录体系包含聚合酶和转录缓冲液；

5、(3)将体外转录后的产物经过滤后进行oligo dt层析纯化；

6、(4)将纯化后的产物进行浓缩，并使用缓冲液进行换液。

7、在某些实施方案中，根据本发明所述的提高新冠全长s蛋白mrna完整性的制备方法，其中，所述聚合酶为t7 rna聚合酶，所述转录缓冲液为包含镁离子盐的缓冲液。

8、在某些实施方案中，根据本发明所述的提高新冠全长s蛋白mrna完整性的制备方法，其中，所述镁离子盐为氯化镁或醋酸镁。

9、在某些实施方案中，根据本发明所述的提高新冠全长s蛋白mrna完整性的制备方法，其中，所述包含镁离子盐的缓冲液的浓度为15-40mm。

10、在某些实施方案中，根据本发明所述的提高新冠全长s蛋白mrna完整性的制备方法，其中，进行体外转录的温度为35-75℃。

11、在某些实施方案中，根据本发明所述的提高新冠全长s蛋白mrna完整性的制备方法，其中，步骤(4)的缓冲液为柠檬酸钠溶液。

12、本发明的第二方面，提供一种具有提高的完整性的新冠全长s蛋白mrna，其通过第一方面所述的方法制备得到。

13、本发明的第三方面，提供一种用于提高新冠全长s蛋白mrna完整性的转录反应液，其包含t7 rna聚合酶和转录缓冲液，其中所述转录缓冲液为包含镁离子盐的缓冲液。

14、本发明的第四方面，提供一种用于新冠全长s蛋白mrna制备的试剂盒，其包含根据第三方面所述的转录反应液。

15、本发明的第五方面，提供本发明所述的新冠全长s蛋白mrna在制备mrna疫苗中的用途。

16、在某些实施方案中，根据本发明所述的用途，其中，所述药物为疫苗。

17、在某些实施方案中，根据本发明所述的用途，其中，所述疫苗为mrna疫苗。

18、本发明的优异技术效果包括但不限于：

19、对于易降解、完整性比例低的长片段mrna(如新冠s蛋白全长mrna)的制备，本发明通过在转录buffer中添加特定浓度的醋酸镁盐型，同时采用oligo dt亲和层析对转录后的mrna进行纯化，获得的终产品完整性比例高，三批次mrna产品的完整性数据均高于biontech同类产品完整性比例(55％-78％)中的最高值(78％)。此外，本发明通过对长片段mrna完整性比例的提升优化，使得长片段mrna的该项指标更能符合法规监管的要求，同时也能最大程度上保证mrna表达效能的发挥。

技术特征：

1.一种提高新冠全长s蛋白mrna完整性的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的提高新冠全长s蛋白mrna完整性的制备方法，其特征在于，所述聚合酶为t7 rna聚合酶，所述转录缓冲液为包含镁离子盐的缓冲液。

3.根据权利要求2所述的提高新冠全长s蛋白mrna完整性的制备方法，其特征在于，所述镁离子盐为氯化镁或醋酸镁。

4.根据权利要求2所述的提高新冠全长s蛋白mrna完整性的制备方法，其特征在于，所述转录缓冲液的浓度为15-40mm。

5.根据权利要求1所述的提高新冠全长s蛋白mrna完整性的制备方法，其特征在于，进行体外转录的温度为35-75℃。

6.根据权利要求1所述的提高新冠全长s蛋白mrna完整性的制备方法，其特征在于，步骤(4)所用的缓冲液为柠檬酸钠溶液。

7.一种具有提高的完整性的新冠全长s蛋白mrna，其特征在于，通过权利要求1-6任一项所述的方法制备得到。

8.一种用于提高新冠全长s蛋白mrna完整性的转录反应液，其特征在于，包含t7 rna聚合酶和转录缓冲液，其中所述转录缓冲液为包含镁离子盐的缓冲液。

9.一种用于新冠全长s蛋白mrna制备的试剂盒，其特征在于，包含根据权利要求8所述的转录反应液。

10.根据权利要求7所述的具有提高的完整性的新冠全长s蛋白mrna在制备用于预防和/或治疗新型冠状病毒sars-cov-2感染的药物中的用途，优选地，所述药物为疫苗，还优选为mrna疫苗。

技术总结
本发明公开一种提高新冠全长S蛋白mRNA完整性的制备方法及用途。该方法包括：(1)制备质粒线性化模板；(2)配制转录体系，进行体外转录；(3)体外转录后的产物经过滤后进行Oligo dT层析纯化；(4)将纯化后的产物进行浓缩，并使用缓冲液进行换液。本发明的方法解决了mRNA本身稳定性差，体外转录制备过程中易降解，从而导致完整性降低的问题，所制备的新冠全长S蛋白mRNA具有显著提高的完整性，同时对产量无任何影响，本发明的制备方法以及转录体系在mRNA疫苗生产中具有广泛应用前景。

技术研发人员：郭小凯,刘东,王凯悦,王玥琦,王素杰,朱效英
受保护的技术使用者：北京启辰生生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14