经修饰的酶的制作方法

本发明涉及一种修饰的dda解旋酶，其可用于控制多核苷酸的移动，并且特别有助于测序多核苷酸。

背景技术：

1、目前需要一种具有广泛的应用范围的快速且廉价的多核苷酸(如dna或rna)测序和鉴定技术。现有的技术是缓慢的且昂贵的，这主要由于它们依赖于扩增技术来产生大量的多核苷酸，且需要大量特定的用于信号检测的荧光化学物质。

2、跨膜孔(纳米孔)作为用于聚合物和各种小分子的直接的、电生物传感器，具有很大的潜力。特别是，目前作为一种有潜力的dna测序技术的纳米孔得到了许多关注。

3、当跨纳米孔施加电势时，在，当分析物如核苷酸在桶(barrel)中短暂停留一段时间时，会产生电流的变化。所述核苷酸的纳米孔检测能产生已知特征和持续时间的电流变化。在链测序方法中，单个多核苷酸链穿过所述孔并实现对核苷酸的鉴定。链测序可包括使用多核苷酸结合蛋白来控制所述多核苷酸穿过所述孔的移动。

技术实现思路

1、令人出乎意料的是，发明人已经鉴定出特异性dda突变体，该突变体具有提升的能力以控制多核苷酸穿过孔的移动。本发明的突变体显示减少的向前滑移(slipping)。这是dna通过至少4个连续核苷酸并且通常通过超过10个连续核苷酸相对孔向前移动的现象。向前滑移可能涉及100个或更多个连续的核苷酸的向前移动，这对于每个多核苷酸可能发生多次。对于多核苷酸测序，向前滑移可能是有问题的。由发明人鉴定的突变体通常包含突变的组合，即(1)与单链dna(ssdna)中的核苷酸相互作用的氨基酸的一个或多个取代，和(2)与跨膜孔相互作用的突变体的一部分上的一个或多个修饰。

2、因此，本发明提供了一种dna依赖性atpase(dda)解旋酶，在其中(a)与单链dna(ssdna)中的一个或多个核苷酸相互作用的至少一个氨基酸被取代，和(b)与跨膜孔相互作用的解旋酶的一部分包括一个或多个修饰，其中，所述解旋酶具有控制多核苷酸的移动的能力。

3、本发明还提供：

4、一种构建体，其包含本发明所述的解旋酶和附加的多核苷酸结合部分，其中，所述解旋酶与所述多核苷酸结合部分连接，并且所述构建体具有控制多核苷酸的移动的能力；

5、一种多核苷酸，其包含对本发明所述的解旋酶或本发明所述的构建体进行编码的序列；

6、一种载体，其包含与启动子可操作地连接的本发明所述的多核苷酸；

7、一种宿主细胞，其包含本发明所述的载体；

8、一种制备本发明所述的解旋酶或本发明所述的构建体的方法，其包括对本发明所述的多核苷酸进行表达，用本发明所述的载体对细胞进行转染或对本发明所述的宿主细胞进行培养；

9、一种控制多核苷酸的移动的方法，包括使所述多核苷酸与本发明所述的解旋酶或本发明所述的构建体接触，从而控制多核苷酸的移动；

10、一种表征目标多核苷酸的方法，包括：(a)使所述目标多核苷酸与跨膜孔和本发明所述的解旋酶或本发明所述的构建体接触，使得所述解旋酶控制目标多核苷酸穿过所述孔的移动；以及(b)随着所述多核苷酸相对于所述孔移动，获取一个或多个测量值，其中所述测量值代表所述目标多核苷酸的一个或多个特征，并由此表征所述目标多核苷酸；

11、一种用于形成表征目标多核苷酸的传感器的方法，包括：在(a)孔和(b)本发明所述的解旋酶或本发明所述的构建体之间形成复合物，从而形成用于表征目标多核苷酸的传感器；

12、一种用于表征目标多核苷酸的传感器，其包含在(a)孔和(b)本发明所述的解旋酶或本发明所述的构建体之间的复合物；

13、本发明所述的解旋酶或本发明所述的构建体的用途，为控制目标多核苷酸穿过孔的移动。

14、一种用于表征目标多核苷酸的试剂盒，其包含(a)孔和(b)本发明所述的解旋酶或本发明所述的构建体；

15、一种用于表征样品中目标多核苷酸的装置，包括(a)多个孔和(b)多个本发明所述的解旋酶或多个本发明所述的构建体；和

16、一系列与多核苷酸连接的两个或多个解旋酶，其中，两个或多个解旋酶中的至少一个是本发明所述的解旋酶。

技术特征：

1.一种dna依赖性atpase(dda)解旋酶，其包括以下在seq id no:8中所示的引入氨基酸序列的突变：

2.根据权利要求1所述的解旋酶，其中，所述较大侧链(r基团)增加了所述f98一个氨基酸与ssdna中一个或多个核苷酸之间的(i)静电相互作用；(ii)氢键和/或(iii)阳离子-pi(阳离子-π)相互作用。

3.根据权利要求1或2所述的dna依赖性atpase(dda)解旋酶，其中，h82,n88,p89,d121,v150,p152,f240,f276,s287,h396和y415中的至少一个被取代，和/或h64,t80,s83,n242,k243,n293,t394和k397中的至少一个被取代。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的解旋酶，其中，h82,n88,p89,d121,v150,p152,f240,f276,s287,h396和y415中的至少一个被包含较大侧链(r基团)的氨基酸取代，所述较大侧链(r基团)包括增加数目的碳原子，具有增加的长度，具有增加的分子体积和/或具有增加的范德华体积。

5.根据权利要求4所述的解旋酶，其中，所述较大侧链(r基团)增加了h82,n88,p89,d121,v150,p152,f240,f276,s287,h396和y415中的至少一个氨基酸与ssdna中一个或多个核苷酸之间的(i)静电相互作用；(ii)氢键和/或(iii)阳离子-pi(阳离子-π)相互作用。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的解旋酶，其中，h82,n88,p89,d121,v150,p152,f240,f276,s287,h396和y415中的至少一个被取代，其中

7.根据权利要求1至6中任一项所述的解旋酶，其中，所述解旋酶包括一个或多个以下在seq id no:8中所示的引入氨基酸序列的突变：

8.根据权利要求1至6中任一项所述的解旋酶，其中，所述解旋酶包括以下在seq idno:8中所示的引入氨基酸序列的突变：

9.根据权利要求1至8中任一项所述的解旋酶，其中，h64,t80,s83,n242,k243,n293,t394和k397中的至少一个被取代，并且h64,t80,s83,n242,k243,n293,t394和k397中至少一个的所述取代增加了所述至少一个氨基酸和所述ssdna中一个或多个磷酸基团之间的(i)静电相互作用；(ii)氢键和/或(iii)阳离子-pi(阳离子-π)相互作用。

10.根据权利要求9所述的解旋酶，其中，所述取代增加了位点的净正电荷。

11.根据权利要求9或10所述的解旋酶，其中，h64,t80,s83,n242,k243,n293,t394和k397中的至少一个被取代，其中，

12.根据权利要求1至11中任一项所述的解旋酶，其中，所述解旋酶包括一个或多个以下在seq id no:8中所示的引入氨基酸序列的突变：

13.根据权利要求1至12中任一项所述的解旋酶，其中，所述解旋酶包括以下位点上的seq id no:8的引入氨基酸序列的突变：

14.根据权利要求1至13中任一项所述的解旋酶，其中，所述解旋酶包括以下位点上的seq id no:8的引入氨基酸序列的突变：

15.根据权利要求1至14中任一项所述的解旋酶，其中，

16.根据权利要求1至15中任一项所述的解旋酶，其中，所述解旋酶包括引入seq idno:8的氨基酸序列的e94c,f98w,c109a,c136a,k194l和a360c突变。

17.一种构建体，其包含根据权利要求1至16中任一项所述的解旋酶和附加的多核苷酸结合部分，其中，所述解旋酶与所述多核苷酸结合部分连接，并且所述构建体具有控制多核苷酸移动的能力。

18.一种表征目标多核苷酸的方法，包括：

19.一种用于表征目标多核苷酸的传感器，包括：在(a)孔和(b)根据权利要求1至16中任一项所述的解旋酶或根据权利要求17所述的构建体之间形成复合物。

技术总结
本发明涉及修饰的Dda解旋酶，其可用于控制多核苷酸的移动，并且特别有助于对多核苷酸进行测序。

技术研发人员：安德鲁·海伦,瑞贝卡·维多利亚·鲍恩,马克·布鲁斯,拉科马·贾亚辛格,约瑟夫·哈格里夫·劳埃德,绍博尔奇·苏罗尔斯,伊丽莎白·杰恩·华莱士,克里斯多夫·彼得·约德
受保护的技术使用者：牛津纳米孔科技公开有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16