一种用于监测氧化还原过程的荧光探针的制备方法及应用

本发明属于分子荧光探针，具体涉及一种用于监测氧化还原过程的荧光探针的制备方法及应用。

背景技术：

1、氧化还原的动态平衡对于有氧生命体维持各项正常的生命活动至关重要，有氧呼吸在为机体提供能量的同时会产生具有强氧化性的活性氧物种(ros)。hclo作为活性氧家族的重要成员，在生物体免疫反应中发挥着重要的作用，其含量水平异常会引起许多免疫相关疾病，例如糖尿病，癌症等。活性氧化物种和还原性物质的氧化还原平衡能够维持调控细胞的正常生理活动，当细胞处于异常状态时，还原性物质不能够有效地消耗掉过量的ros，致使氧化还原失衡，进一步导致细胞功能异常，最终引发各种疾病。检测氧化还原状态的化学荧光探针具有能与信号分子结合的识别基团以及发出荧光信号的基团，通过发出荧光的强度来反映氧化还原状态。因此实时监测细胞内ros与还原性物质之间的动态平衡能够帮助我们理解和调控细胞内氧化还原状态。

2、近年来，荧光成像及荧光探针技术由于其高灵敏度、高时间和空间分辨率、实时原位和非侵入性检测的特点而被广泛用于生物活性物种检测开发中。目前有许多单一检测氧化性物种或者还原性物种的荧光探针，但是能够动态检测氧化还原过程的探针并不是很多。因此发展一种简单有效的荧光探针可以用于动态监测细胞内氧化还原过程具有重要的研究意义和实用价值。

技术实现思路

1、本发明的目的是解决细胞内活性氧ros与还原性物质之间动态平衡的实时监测问题，提供一种用于监测氧化还原过程的荧光探针的制备方法及应用。

2、本发明的技术方案

3、为实现上述目的，本发明首先提供了一种用于监测氧化还原过程的荧光探针，该探针的化学名称为2-(6-(二乙基氨基-3-氧代-3h-氧杂蒽-9-基)-3,5,6-三氟-4-((3-苯基硒酰基)丙基氨基)苯甲酸，简称为rhodol-se，结构如式(ι)所示：

4、

5、该探针可以监测clo-/gsh这一氧化还原对的氧化还原过程。

6、本发明同时提供了一种上述用于监测氧化还原过程的荧光探针的制备方法，该方法所用原料易得、合成步骤简单及产率高，具体合成路线如下：

7、

8、合成步骤如下：

9、s1、将2-(4-(二乙氨基-2-羟基苯甲酰基)-四氟苯甲酸和间苯二酚在甲磺酸中反应得到rhodol-f；

10、s2、将二苯基二硒醚和氢氧化钠置于有机溶剂中反应，再加入硼氢化钠nabh4反应，在反应混合物中加入n-(3-溴丙基)邻苯二甲酰亚胺继续反应最终得到产物z1所示化合物；

11、s3、将化合物z1和水合肼在有机溶剂中进行水解反应，得到产物z2所示化合物；

12、s4、将步骤s1得到的rhodol-f与z2在有机溶剂中进行取代反应得到如式ι所示的化合物rhodol-se。

13、作为部分实施方式，s1中，所述2-(4-(二乙氨基-2-羟基苯甲酰基)-四氟苯甲酸和间苯二酚的摩尔比为1:1.1～1.5，优选为1：1.3；如果间苯二酚的添加比例较小，则反应时间会较长且容易生成副产物。如果间苯二酚的添加比例较大，则会增加反应成本。所述2-(4-(二乙氨基-2-羟基苯甲酰基)-四氟苯甲酸和间苯二酚的总重量与甲磺酸溶剂的重量比为1:20～30。反应温度优选为60℃～95℃。

14、作为部分实施方式，s2中，所述二苯基二硒醚、氢氧化钠、硼氢化钠和n-(3-溴丙基)邻苯二甲酰亚胺的摩尔比为1：1.5～3：1～2.5：1.5～2，优选为1：2.5：2：2；所述二苯基二硒醚、氢氧化钠、硼氢化钠与n-(3-溴丙基)邻苯二甲酰亚胺的总重量和有机溶剂的重量比为1：9～15；所述有机溶剂选择醇类有机溶剂，优选为乙醇；反应温度优选为25℃～50℃。

15、作为部分实施方式，s3中，所述化合物z1和水合肼的摩尔比为1：2～4.5，优选为1：4.1；化合物z1和水合肼的总重量与乙醇溶剂的重量比为1：1.5～10；水解反应有机溶剂选择醇类有机溶剂，优选为乙醇；反应温度优选为25℃～50℃。

16、由于化合物中存在-nh2和-se，二者均容易被氧化，因此温度不宜过高。

17、作为部分实施方式，s4取代反应中，所述rhodol-f与z2的摩尔比为1：1～1.5，优选为1：1.2；rhodol-f和z2的总重量与dmf溶剂的重量比为1：5～9，由于dmf的沸点较高，不易除去，因此不宜量多；反应温度优选为20℃～50℃，时间为18～30小时。

18、作为部分实施方式，s1-s4中均优先采用硅胶柱层析进行纯化。

19、本发明还提供了上述荧光探针在检测细胞氧化还原过程中的应用。

20、本发明的优点和有益效果：

21、本发明提供的荧光探针的产率较高，可以动态监测clo-/gsh氧化还原过程，可以实现在细胞内源和外源clo-/gsh的检测，对clo-/gsh这一氧化还原对具有特异性响应，灵敏度较高，信噪比低，有良好的光学稳定性。本发明探针的最大吸收波长在530nm左右，最大发射波长为575nm(图2)，探针对clo-/gsh的识别机制是分子内诱导电子转移(pet)，从而具有高灵敏度(检测限低于10-8m/l)。而且本发明的探针具有良好的生物膜透性和较低的细胞毒性，可以实现细胞中对clo-/gsh氧化还原过程的检测(图3)。

技术特征：

1.一种用于监测氧化还原过程的荧光探针，该探针的化学名称为2-(6-(二乙基氨基-3-氧代-3h-氧杂蒽-9-基)-3,5,6-三氟-4-((3-苯基硒酰基)丙基氨基)苯甲酸，简称为rhodol-se，可以监测clo-/gsh这一氧化还原对的氧化还原过程，其结构如下式(ι)所示：

2.一种权利要求1所述的用于监测氧化还原过程的荧光探针的制备方法，其特征在于：具体制备路线如下：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤s1中所述的2-(4-(二乙氨基-2-羟基苯甲酰基)-四氟苯甲酸和间苯二酚的摩尔比为：1：1.1～1.5，优选1：1.3。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤s1中所述的2-(4-(二乙氨基-2-羟基苯甲酰基)-四氟苯甲酸和间苯二酚的总重量与甲磺酸的重量比为1：20～30；反应温度为60℃～95℃。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤s2中所述的二苯基二硒醚、氢氧化钠、硼氢化钠和n-(3-溴丙基)邻苯二甲酰亚胺的摩尔比为1：1.5～3：1～2.5：1.5～2，优选为1：2.5：2：2。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤s2中所述的二苯基二硒醚、氢氧化钠、硼氢化钠与n-(3-溴丙基)邻苯二甲酰亚胺的总重量和有机溶剂的重量比为1：9～15；所述有机溶剂选择醇类有机溶剂，优选为乙醇；反应温度优选为25℃～50℃。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤s3中所述的化合物z1和水合肼的摩尔比为1：2～4.5，优选为1：4.1；化合物z1和水合肼的总重量与有机溶剂的重量比为1：1.5～10。

8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤s3中水解反应有机溶剂选择醇类有机溶剂，优选为乙醇；反应温度优选为25℃～50℃。

9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤s4中所述的化合物rhodol-f与z2的摩尔比为1：1～1.5，优选为1：1.2；s4中的取代反应温度为20～50℃，时间为18～30小时。

技术总结
本发明公开了一种用于监测氧化还原过程的荧光探针的制备方法及应用，属于有机小分子荧光探针技术领域。本发明提供的荧光探针如式(I)所示，是以Rhodol基团为母体，在底环上引入强吸电子基团F原子，利用底环4号位上氟原子的高活性引入苯基硒基团，利用硒原子的氧化还原电位设计合成的可以检测ClO<supgt;‑</supgt;/GSH氧化还原过程的探针。本发明的氧化还原型荧光探针，能够实现细胞外源ClO<supgt;‑</supgt;/GSH氧化还原过程的检测；并且对ClO<supgt;‑</supgt;/GSH具有特异性响应，高灵敏度及良好的光学稳定性；同时本发明提供的该探针的制备产率较高。

技术研发人员：曾宪顺,李迪,刘畅,何松
受保护的技术使用者：天津理工大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14