一种丝素蛋白单克隆抗体的制备方法及其在胶体金试纸中的应用

本发明属于用于检测丝素蛋白的胶体金试纸的，更具体涉及一种丝素蛋白单克隆抗体的制备方法及其在胶体金试纸中的应用。

背景技术：

1、中国自古以来就是纺织品大国，生产的纺织品种类丰富，工艺精美，舒适透气。其中最负盛名的纺织品就是中国的丝绸，故中国又被称为“丝绸之国”。丝绸文物不仅具有科技、文化、艺术等多方面的价值，更是社会交替，人文交融的历史见证者。丝绸文物中丝绸的主要成分是桑蚕丝，桑蚕丝主要由丝素蛋白和丝胶两部分组成，丝素蛋白是蚕丝的主要组成部分，约占总重量的70％。但是，丝绸文物中的桑蚕丝作为一种有机高分子材料，由于常年处于地下墓葬环境中易受光、热、酸碱、微生物等的影响发生降解，从而造成结晶度、分子量等结构及性能的变化，另一方面，丝绸文物出土时往往会伴有许多杂质，真正的有效成分极少。而常规的丝素蛋白检测方法灵敏度低，受杂质干扰影响大，不适合对丝绸文物进行检测，因此需要开发一种可用于现场，特异性强的检测古代丝织品的方法存在着很重要的意义。

技术实现思路

1、鉴于此，为实现上述目的，本发明提供了一种丝素蛋白单克隆抗体的制备方法及其在胶体金试纸中的应用。

2、本发明的具体技术方案为：一种丝素蛋白单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

3、1)将丝素蛋白粉末溶解在生理盐水中，加入弗氏完全佐剂乳化完全，得到抗原乳液；在小鼠皮下和腹腔多处注射抗原乳液进行初次免疫，然后用弗式不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，分别在第二周、第四周、第六周对小鼠进行加强免疫；＝

4、2)切除小鼠脾脏，将脾脏放置在包含imdm培养基的玻璃盘中，挤出脾脏细胞；在细胞融合前，骨髓瘤细胞在8-单杂鸟嘌呤中培养，将生长情况良好的骨髓瘤细胞与上述含有脾脏细胞的imdm培养基混合，加入聚乙二醇，再进行离心后弃上清液，得到融合后的杂交瘤细胞悬液；

5、3)将融合后的杂交瘤细胞悬液包被到孔板上培养，收集后采用免疫亲和层析柱进行纯化，得到丝素蛋白单克隆抗体。

6、在对小鼠注射抗原乳液进行免疫时，使用弗氏完全佐剂诱导产生高强度的抗体，可以加强对抗原的抗体反应，再使用弗式不完全佐剂取代弗氏完全佐剂，可以减少副作用，加强免疫。选取骨髓瘤细胞用于制备单克隆抗体，因为其是b淋巴细胞杂交瘤技术中最理想的脾细胞伴侣，将脾脏作为与骨髓瘤细胞融合的细胞来源，在细胞融合前骨髓瘤细胞在8-氮杂鸟嘌呤中培养，可以确保其对imdm选择培养基的敏感性。接着，将骨髓瘤细胞与脾细胞混合，得到阳性杂交瘤细胞。将阳性杂交瘤细胞进行培养之后，使用免疫亲和层析柱进行纯化，可得到特异性强的单克隆抗体，其能够和抗原发生特异性更强的结合，体能够降低丝素蛋白的检测限。

7、进一步优选的，步骤1)的制备方法具体为：将1-5mg丝素蛋白粉末溶解在1-3ml生理盐水中，与1-6ml弗氏完全佐剂乳化完全，得到抗原乳液；初次免疫时在小鼠皮下和腹腔多处注射50-300μl上述抗原乳液，然后用弗式不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，分别在第二周、第四周、第六周对小鼠进行加强免疫。

8、进一步优选的，步骤2)的制备方法具体为：切除小鼠脾脏，将脾脏放置在包含imdm培养基的玻璃盘中，挤出脾脏细胞；在细胞融合前4-8d，骨髓瘤细胞在8-氮杂鸟嘌呤中培养，将生长情况良好的骨髓瘤细胞按照1-3:7-10的比例与上述含有脾脏细胞的imdm培养基混合，加入1-7ml聚乙二醇，以500-1200r/min离心后弃上清液，得到融合后的杂交瘤细胞悬液。

9、进一步优选的，步骤3)的制备方法具体为：将融合后的杂交瘤细胞悬液按每孔100μl包被到孔板上培养4-7d，收集后采用免疫亲和层析柱进行纯化，获得的单克隆抗体在-20℃下保存备用。

10、一种上述制备方法制得的丝素蛋白单克隆抗体在胶体金试纸中的应用。

11、进一步优选的，所述胶体金试纸的制备方法包括如下步骤：

12、步骤1：胶体金溶液的制备；

13、步骤2：胶体金与抗体的偶联：将胶体金溶液的ph值调节为7.5-9，加入丝素蛋白单克隆抗体，置于37℃条件下搅拌孵育，然后加入牛血清蛋白溶液作为抗体封闭剂，继续搅拌孵育；将得到的溶液离心后，弃上清液，得到胶体金标记抗体；

14、步骤3：胶体金试纸的制备：先对样品垫和金标垫采用含pluracare1307prill的磷酸盐缓冲溶液进行预处理，然后将胶体金标记抗体喷涂在金标垫上；将丝素蛋白抗原、羊抗鼠igg用缓冲液稀释，再在硝酸纤维素膜上划线包被，形成检测线和质控线；最后将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次粘贴在pvc底板上，得到胶体金试纸。

15、将胶体金溶液的ph值调节为弱碱性，是因为抗体需要在弱碱性条件下才能与胶体金相结合且结合牢固，可以提高试纸的检测效果。并且，采用pluracare1307prill对样品垫和金标垫进行预处理，能使其的界面状态发生明显变化，可减少nc膜对被检测物质和金标的吸收，背景干净且无t线反白现象，提高一定的灵敏度，即有增色作用。

16、进一步优选的，所述胶体金溶液的制备为采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液。

17、进一步优选的，步骤1具体为：将30-200ml浓度为0.01-0.3g/l的氯金酸加入到预处理过的锥形瓶，然后加热搅拌至沸腾，接着迅速加入3-10g/l柠檬酸三钠溶液，氯金酸溶液由淡黄色转变成酒红色，溶液不再发生颜色变化后停止加热；继续搅拌2-10min，得到胶体金溶液。

18、进一步优选的，步骤2具体为：取2-8ml胶体金溶液，调节其ph值为7.5-9，加入2-13μl丝素蛋白单克隆抗体，混合后置于37℃条件下搅拌孵育0.3-3h；然后加入5-30μl牛血清蛋白溶液作为抗体封闭剂，继续搅拌孵育10-35min；将得到的溶液以10000-15000r/min转速离心后，弃上清液，得到胶体金标记抗体。

19、进一步优选的，步骤3具体为：先对样品垫和金标垫进行预处理，将其完全浸没于pluracare1307prill浓度为1-2ml/l的磷酸盐缓冲溶液(ph＝7.4)中，取出后烘干；然后使用喷金划膜机将胶体金标记抗体喷涂在金标垫上，喷涂量为1-5μl/cm；将丝素蛋白抗原、羊抗鼠igg用缓冲液稀释，再用喷金划膜机在硝酸纤维素膜上划线包被，划线量为1-6mg/ml，形成间隔2-6mm检测线和质控线；最后将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次粘贴在pvc底板上，用切条机处理成4mm宽的试纸保存备用。

20、相比于现有技术，本发明具有以下优点：该丝素蛋白的单克隆抗体能够降低丝素蛋白的检测限，并且由于抗原抗体的特异性结合，本发明能够排除各项杂质的干扰，降低检测限，提高检特异性和准确性；利用胶体金与丝素蛋白抗体相结合，实现了对丝绸类纺织品文物的定性和定量检测。

技术特征：

1.一种丝素蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的丝素蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤1)的制备方法具体为：将1-5mg丝素蛋白粉末溶解在1-3ml生理盐水中，与1-6ml弗氏完全佐剂乳化完全，得到抗原乳液；初次免疫时在小鼠皮下和腹腔多处注射50-300μl上述抗原乳液，然后用弗式不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，分别在第二周、第四周、第六周对小鼠进行加强免疫。

3.如权利要求1所述的丝素蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤2)的制备方法具体为：切除小鼠脾脏，将脾脏放置在包含imdm培养基的玻璃盘中，挤出脾脏细胞；在细胞融合前4-8d，骨髓瘤细胞在8-氮杂鸟嘌呤中培养，将生长情况良好的骨髓瘤细胞按照质量比1-3:7-10的比例与上述含有脾脏细胞的imdm培养基混合，加入1-7ml聚乙二醇，以500-1200r/min离心后弃上清液，得到融合后的杂交瘤细胞悬液。

4.如权利要求1所述的丝素蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤3)的制备方法具体为：将融合后的杂交瘤细胞悬液按每孔100μl包被到孔板上培养4-7d，收集后采用免疫亲和层析柱进行纯化，获得的单克隆抗体在-20℃下保存备用。

5.一种如权利要求1-4的任一项所述的制备方法制得的丝素蛋白单克隆抗体在胶体金试纸中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述胶体金试纸的制备方法包括如下步骤：

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述胶体金溶液的制备为采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤1具体为：将30-200ml浓度为0.01-0.3g/l的氯金酸加入到预处理过的锥形瓶，然后加热搅拌至沸腾，接着迅速加入3-10g/l柠檬酸三钠溶液，氯金酸溶液由淡黄色转变成酒红色，溶液不再发生颜色变化后停止加热；继续搅拌2-10min，得到胶体金溶液。

9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤2具体为：取2-8ml胶体金溶液，调节其ph值为7.5-9，加入2-13μl丝素蛋白单克隆抗体，混合后置于37℃条件下搅拌孵育0.3-3h；然后加入5-30μl牛血清蛋白溶液作为抗体封闭剂，继续搅拌孵育10-35min；将得到的溶液以10000-15000r/min转速离心后，弃上清液，得到胶体金标记抗体。

10.如权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤3具体为：先对样品垫和金标垫进行预处理，将其完全浸没于pluracare 1307prill浓度为1-2ml/l的磷酸盐缓冲溶液中，取出后烘干；然后使用喷金划膜机将胶体金标记抗体喷涂在金标垫上，喷涂量为1-5μl/cm；将丝素蛋白抗原、羊抗鼠igg用缓冲液稀释，再用喷金划膜机在硝酸纤维素膜上划线包被，划线量为1-6mg/ml，形成间隔2-6mm检测线和质控线；最后将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次粘贴在pvc底板上，用切条机处理成4mm宽的试纸保存备用。

技术总结
本发明涉及用于检测丝素蛋白的胶体金试纸的技术领域，公开了一种丝素蛋白单克隆抗体的制备方法及其在胶体金试纸中的应用，所述丝素蛋白单克隆抗体的制备方法包括如下步骤：1)将丝素蛋白粉末溶解在生理盐水中，加入弗氏完全佐剂乳化完全，得到抗原乳液；在小鼠皮下和腹腔多处注射抗原乳液进行初次免疫和加强免疫；2)切除小鼠脾脏，将脾脏作为与骨髓瘤细胞融合的细胞来源，得到融合后的杂交瘤细胞悬液；3)将融合后的杂交瘤细胞悬液包被到孔板上培养，得到丝素蛋白单克隆抗体。本发明将丝素蛋白单克隆抗体应用于胶体金试纸的制备中，由于抗原抗体的特异性结合，能够排除各项杂质的干扰，降低检测限，提高特异性和准确性。

技术研发人员：邓烨丰,王秉,刘锋,邵帅
受保护的技术使用者：浙江理工大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13