一种离体线粒体的体外储存方法

本发明涉及生物学，具体而言，涉及一种离体线粒体的体外储存方法。

背景技术：

1、线粒体参与了多种病理生理过程的发生与发展，关于线粒体的研究越来越受到研究者们的关注。其中，维持线粒体体外活性和功能是开展线粒体研究的必要条件。

2、目前临床与实验中对离体线粒体的主要保存手段为线粒体储存液或0.01m的pbs(phosphate-buffered saline，磷酸盐)缓冲液，这两种储存方法主要通过为离体线粒体提供适当的渗透压和中性ph环境来维持其活性。然而由于这两种储存液主要成分为无机盐，缺乏抗氧化活性物质，对线粒体中的重要酶活性保护能力有限，无法满足线粒体的长时间体外储存，限制了线粒体相关研究和应用。

3、现有的技术可以实现将线粒体导入包含完整细胞器单元的有核细胞中，如白细胞、淋巴细胞等，此类技术多为将线粒体导入具有结构完整但功能受损的细胞，其本质目的为通过线粒体的移植实现对受体细胞的受损线粒体功能修复，最终修复或增强受体细胞功能，不以线粒体的体外保存为目的，并且线粒体在靶细胞中发挥生物合成和供能功能，其呼吸模式受到靶细胞环境调控，使得线粒体的功能和类型发生在受体细胞中发生重编程，失去线粒体的原有特征，这种线粒体的细胞移植保存无法满足对线粒体原有特征的维持和保护。

技术实现思路

1、本发明针对线粒体的体外保存效果差，保存时间短的问题，创新性的采用利用无线粒体细胞作为载体，为线粒体提供最接近胞内环境的储存条件的方式保护线粒体功能和活性，来解决上述问题。

2、发明人发现：对于有核细胞而言，在受体细胞自身线粒体未被清除的情况下，异质性的线粒体最终会被细胞所清除，无法长期保存外源线粒体。同时，这种有核细胞中含有复杂细胞成分和细胞器，增加了重新提取线粒体的难度，线粒体的纯度也因此降低。

3、具体地，发明人利用不具有线粒体的细胞作为载体(较优地，选择成熟红细胞这一类天然缺乏细胞核和细胞器的细胞作为载体)，为线粒体提供了最接近胞内环境的储存条件，极大的保护了线粒体功能和活性，延长了线粒体的体外保存时间。同时受益于红细胞成分与结构简单，线粒体作为一种敏感的细胞器不易受到胞内成分的刺激发生呼吸方式重编程。而且，红细胞中的线粒体的重收集方法简单，即释放红细胞中包含的线粒体时较为便捷，不需要复杂的分离步骤和分离试剂，增加了这种储存系统的可操作性。

4、本发明的实施例通过以下技术方案实现：

5、一种离体线粒体的体外储存方法，主要是将离体线粒体储存于不具有线粒体的受体细胞中，较优地，受体细胞也不具有细胞核，这样更加有利于外源细胞体的进入；具体地，包括以下步骤：

6、s1.分别提取相同或不同的受试者的红细胞、线粒体，并分别制得红细胞悬液和线粒体悬液；

7、s2.向红细胞中导入线粒体：将s1中取得的线粒体悬液和红细胞悬液混合后，经离心去掉上清液后，获得包含线粒体的红细胞沉淀，随后将细胞分散在红细胞保存液中。

8、更进一步地，包括以下步骤：

9、1.1红细胞提取

10、通过腹腔注射4％-10％麻醉剂(苯巴比妥钠、戊巴比妥钠、硫喷妥钠、氨基甲酸乙脂、水合氯醛)1-3ml对小鼠(nude、balb/c、c57bl/6、昆明鼠)进行麻醉，取小鼠外周血0.1-1.5ml，在4℃-25℃条件下100-2000×g离心1-20分钟，离心结束后去掉上清，获得红细胞沉淀，使用1-1000ml pbs重悬红细胞备用。

11、1.2线粒体提取

12、使用脱颈椎法处死小鼠(nude、balb/c、c57bl/6)，随后分离小鼠组织(心脏、肌肉、脾脏、肾脏、肝脏)或外周血白细胞，使用(0.05％-0.5％)的胰酶在4℃-37℃条件下对组织进行消化15-120分钟。机械研磨后使用50-200目细胞筛将组织过滤为单细胞悬液，在4℃-25℃条件下100-2000×g离心1-20分钟，离心结束后去掉上清，获得细胞沉淀。使用1-100倍细胞沉淀体积的线粒体分离液以及线粒体裂解液4℃-25℃条件下处理细胞5-120分钟，随后4℃-25℃条件下100-2000g离心1-20分钟，离心结束后去掉上清，获得线粒体沉淀，使用1-1000ml pbs重悬线粒体备用；

13、1.3向红细胞中导入线粒体

14、将1.1和1.2中获得的线粒体悬液和红细胞悬液按照20:1-1:20的比例混合，4℃-25℃条件下100-2000g离心1-20分钟，离心结束后去掉上清，获得包含线粒体的红细胞沉淀，随后将细胞分散在1-100ml红细胞保存液中。

15、本发明实施例的技术方案至少具有如下优点和有益效果：

16、本发明针对线粒体的体外保存效果差，保存时间段的问题，创新性的利用天然缺乏细胞核和细胞器的细胞作为载体，优选成熟红细胞，为线粒体提供了最接近胞内环境的储存条件，极大的保护了线粒体功能和活性，延长了线粒体的体外保存时间。同时受益于红细胞成分与结构简单，线粒体作为一种敏感的细胞器不易受到胞内成分的刺激发生呼吸方式重编程。而且，红细胞中的线粒体的重收集方法简单，即可更容易地释放红细胞中包含的线粒体，不需要复杂的分离步骤和分离试剂，增加了这种储存系统的可操作性。

技术特征：

1.一种离体线粒体的体外储存方法，其特征在于，将离体线粒体储存于不具有线粒体的受体细胞中。

2.根据权利要求1所述的离体线粒体的体外储存方法，其特征在于，所述受体细胞不具有细胞核。

3.根据权利要求1或2所述的离体线粒体的体外储存方法，其特征在于，所述离体线粒体为从供体细胞分离的离体线粒体，所述供体细胞和所述受体细胞获自相同或不同的受试者。

4.根据权利要求1或2所述的离体线粒体的体外储存方法，其特征在于，所述受体细胞为红细胞。

5.根据权利要求4所述的离体线粒体的体外储存方法，其特征在于，所述受体细胞为红细胞。

6.根据权利要求5所述的离体线粒体的体外储存方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的离体线粒体的体外储存方法，其特征在于，步骤s1包括s11.红细胞提取：取受试者外周血，离心一段时间，离心结束后去掉上清液，获得红细胞沉淀，经重悬后得到红细胞悬液。

8.根据权利要求6所述的离体线粒体的体外储存方法，其特征在于，步骤s1还包括s12.线粒体提取：取受试者组织，使用胰酶对组织消化一段时间，经研磨过筛将组织过滤为单细胞悬液；再离心分离得到细胞沉淀，处理细胞沉淀，随后离心分离获得线粒体沉淀，经重悬后得到线粒体悬液。

9.根据权利要求6所述的离体线粒体的体外储存方法，其特征在于，步骤s1还包括s13.线粒体提取：取受试者外周血，使用红细胞裂解液去除红细胞；再离心分离得到细胞沉淀，处理细胞沉淀，随后离心分离获得线粒体沉淀，经重悬后得到线粒体悬液。

10.根据权利要求1所述的离体线粒体的体外储存方法，其特征在于，s2中线粒体悬液和红细胞悬液按照20:1-1:20的比例混合。

技术总结
本发明涉及生物学技术领域，为解决线粒体的体外保存效果差，保存时间短的问题，创新性的采用利用无线粒体细胞作为载体，为线粒体提供最接近胞内环境的储存条件的方式保护线粒体功能和活性，来解决上述问题；本发明提供了一种离体线粒体的体外储存方法，主要是将离体线粒体储存于不具有线粒体的受体细胞中，极大的保护了线粒体功能和活性，延长了线粒体的体外保存时间；且可更容易地释放红细胞中包含的线粒体，不需要复杂的分离步骤和分离试剂，增加了这种储存系统的可操作性。

技术研发人员：周兴
受保护的技术使用者：重庆理工大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13